Summary
In deze video, zullen we laten zien hoe je netvlies stamcellen uit het ciliaire epitheel van de muis oog te isoleren en te groeien ze in cultuur tot klonale netvlies bollen te vormen. De bollen die zijn geïsoleerd beschikken over de kardinale eigenschappen van stamcellen: self-vernieuwing en multipotentiality.
Abstract
De volwassen muis retinaal stamcellen (RSC) is een zeldzame rustende cel gevonden binnen de ciliaire epitheel (CE) van de zoogdieren oog 1,2,3. Het CE bestaat uit niet-gepigmenteerde binnen-en gepigmenteerde buitenste cellagen, en de klonale RSC kolonies die voortvloeien uit een enkele gepigmenteerde cel uit het CE zijn opgebouwd uit zowel gepigmenteerde en niet-gepigmenteerde cellen die kunnen worden gedifferentieerd om alle vormen celtypen van de neurale netvlies en de RPE. Er is enige controverse over de vraag of alle cellen in de sferen bevatten alle ten minste een aantal pigment 4, maar de cellen zijn nog in staat de vorming van de verschillende celtypes gevonden binnen de neurale netvlies 1-3. Bij sommige soorten, zoals amfibieën en vissen, hun ogen zijn in staat om de regeneratie na verwonding 5, echter, de zoogdieren oog vertoont geen regeneratieve eigenschappen. Wij streven ernaar om de stamcellen in vivo te identificeren en om de mechanismen die ervoor zorgen dat het zoogdier netvlies stamcellen rust 6-8 te begrijpen, zelfs nadat zowel de schade als het gebruik ervan als een potentiële bron van cellen te repareren fysieke of genetische modellen van de verwonding aan het oog te helpen door middel van transplantatie 9-12. Hier beschrijven we hoe u de ciliaire epitheel cellen van de muis oog te isoleren en te groeien ze in de cultuur om de klonale netvlies stamcellen bollen te vormen. Aangezien er geen bekende merkers van de stamcellen in vivo, deze gebieden zijn de enige bekende manier om de stamcellen bevolking prospectief identificeren op het ciliaire epitheel van het oog.
Protocol
1. Bereid de ontleden Solutions en Enzyme-oplossingen
- Maak de Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) en de serum-vrij Media van tevoren in de koelkast.
- Weeg de Kynurenic Acid (0,2 mg / ml) en los op in 10 ml Hilo ACSF in een 37 ° C waterbad van tevoren omdat het niet goed oplosbaar.
- Weeg de trypsine (1,33 mg / ml) en hyaluronidase (0,67 mg / ml) en doe dit in een 15 ml tube en houd het bij -20 ° C totdat het nodig is. Voeg de Kynurenic Acid oplossing voor deze buis en filter met behulp van een 22 um spuitfilter vlak voor gebruik.
- Weeg trypsine-remmer (Ovamucoid: 1 mg / ml) en lossen in warm serumvrij Media en filter met behulp van 22μm spuitfilter.
- Maak de plating media: Serum-vrije media die FGF2 (10 ng / ml) en Heparine (2 ug / mL).
2. Het isoleren van stamcellen uit het netvlies van de muis Eye
- Isolatie van de retinale stamcellen is uitgevoerd in een specifieke steriele zaal gewijd aan de primaire cultuur experimenten. Voorafgaand aan deze procedure start, het opzetten van de dissectiemicroscoop en koud-lichtbron, en dan lay-out van de steriele ontleden instrumenten. Elke kap heeft een warme kraal sterilisator voor het steriliseren van de instrumenten die tussen de stappen.
- We zullen isoleren van stamcellen uit het netvlies ogen die zijn direct geplaatst in een steriele petrischaal met kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) na hun verwijdering uit muizen opgeofferd volgens goedgekeurde dierethiek protocollen.
- Onder de microscoop ontleden, reinig het oog met een tang: zich te ontdoen van het haar en het bindweefsel, dat is aangesloten op het hoornvlies / sclerale grens. Vervolgens overbrengen het oog naar een nieuwe schotel met ACSF.
- Terwijl voorzichtig houdt het oog stationaire met gekartelde tang, gebruik schuine micro-ontleden schaar om de oogspieren te verwijderen. Verwijder de oogzenuw en als het nog aan het oog. Probeer niet voor het oog squish tijdens dit proces. Overdracht ogen om een nieuwe schotel met ACSF.
- Volgende gebruik van gebogen micro-ontleden schaar voor het oog gehalveerd: bij de oogzenuw beginnen en snijden door het midden van het hoornvlies, vergadering terug op de oogzenuw wanneer de snit was gestart. Het is ideaal als de twee stukken van de ogen zijn ongeveer gelijk in grootte, want dit zal de volgende stap gemakkelijker te maken.
- Houd de hoornvliezen met behulp van twee tang voorzichtig schil de twee in het oog helften uit elkaar. Verwijder de lens, de ingewanden, en de neurale netvlies van het oog schelpen. Breng de schelpen aan een nieuwe schotel met ACSF.
- Nu zijn we klaar om de ciliaire epitheel te isoleren. Om te beginnen, oriënteren in het oog shell, zodat het hoornvlies is aan uw rechterhand en de Retinal Gepigmenteerde epitheel (RPE) is aan de linkerkant. Voorzichtig pin in het oog schelp naar beneden met rechte tang aan de RPE kant.
- Vervolgens gebruikt u een scalpel aan het hoornvlies en de iris weggesneden uit het ciliaire epitheel van het oog door zachtjes naar beneden te duwen op de scalpel in plaats van zagen bewegingen.
- Daarna, snijd de ciliaire epitheel weg van de RPE. Gebruik niet-getande tang om de strook van de ciliaire epitheel over te dragen aan een nieuwe 35-mm schotel met ACSF.
- Op dezelfde manier, isoleren van de ciliaire epitheel van het andere oog shell.
- Zodra beide ciliaire epitheel stroken zijn verzameld, de overdracht van de strips in een 35-mm schotel met 2 ml Dispase. Plaats de schaal met de strips in een 37 ° C incubator gedurende 10 minuten.
- Na 10 minuten, overdracht van de stroken van het Dispase in een schotel met 2 ml gefilterd Trypsine, hyaluronidase, en Kynurenic Acid. Zet de schaal bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
- Ga nu terug naar het ontleden microscoop. Terwijl u de sclera naar beneden met rechte tang, gebruik maken van de onderkant van de gebogen niet-getande tang voorzichtig schrapen het ciliaire epitheel weg van de sclera.
- Haal de sclera van de schotel. Het enige dat moet worden overgelaten nu in de schotel zijn de cellen van belang en het enzym oplossing.
- Met behulp van een brand-gepolijste katoen-plugged pipet deze oplossing in een 14 ml buis. Vermaal deze oplossing 30 keer te breken behalve de epitheelcellen door voorzichtig waardoor de oplossing in en uit de pipet.
- Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 1500 RPM. Wanneer het centrifugeren is gedaan, de buis voorzichtig te verwijderen uit de centrifuge, omdat de cellen zijn gevoelig voor komende uit de bodem van de buis in dit stadium.
- Zuig voorzichtig het grootste deel van het supernatant met behulp van een brand-gepolijste pipet en voeg 1 ml trypsine-remmer in serum-vrij Media naar de cellen. Gebruik een klein boorgat katoen aangesloten pipet om het monster vermaal ongeveer 50 maal in totdat deze is een single-celsuspensie.
- Nogmaals centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 1500 RPM.
- Verwijder het supernatant en vervang deze door 1 ml van uw plating medium. Vermaal voorzichtig met een brand-geslepen glazen pipet om de cellen te mengen.
- Na teling van de cellen, plaat ze op de gewenste dichtheid in een 24-well plaat. We meestal plaat 10 cellen / microliter door het invullen van elk putje eerst met medium en daarna het toevoegen van de celsuspensie tot een eindvolume van 500 ul van de media te krijgen.
- Plaats de plaat in een 37 ° C CO 2 incubator waar het niet zal worden verplaatst totdat u rekenen de sferen die zich voordoen na 7 dagen.
3. Resultaten van het netvlies isoleren stamcellen
- Wanneer deze procedure met succes wordt uitgevoerd, moet de ontleed ciliaire epitheel cellen er als volgt uitzien nadat ze losgekoppeld en uitgeplaat bij een lage dichtheid (figuur 1).
- Na 7 dagen in cultuur, zijn de retinale stamcellen sferen die zich voordoen geteld. Een bol moet worden meer dan 75 micrometer in diameter en vrij zwevende te worden meegeteld als een stamcellen afgeleid sfeer. (Figuur 2). Toch zullen sommige cellen hebben een beperkte verspreiding en de vorm spheroids die niet voldoen aan deeltjesgrootte en zal niet worden geteld als stamcellen afgeleid bollen, een voorbeeld van een dergelijk sferoïde is hier te zien (figuur 2).
4. Representatieve resultaten
Figuur 1.
Figuur 2.
Discussion
Dit protocol beschrijft hoe te isoleren van stamcellen uit het netvlies van de ciliaire epitheel van de muis oog 1-3. De methodologie voor het isoleren van de strips van ciliaire epitheel kan variëren, maar de enzymen en de methodologie voor het bereiken van een single-celsuspensie zijn geoptimaliseerd in dit protocol. Het is ook belangrijk dat de strips van de ciliaire epitheel die zijn geïsoleerd geen grote hoeveelheden van de RPE of hoornvlies bevatten omdat deze lijken een negatieve invloed op het totaal aantal bollen dat kan worden geïsoleerd van elk oog hebben. Daarnaast is de serum-vrije media die we maken die oorspronkelijk was ontwikkeld voor de hersenen neurospheres 13, is ideaal voor het verbouwen van het netvlies stamcellen bollen. Men moet er ook voor zorgen dat de cellen niet worden verstoord nadat ze zijn verguld en geplaatst in de couveuse, zodat de groeiende bollen niet samenklonteren 14.
Zodra het netvlies stamcellen hebben gevormd klonale bollen, kunnen ze worden gerekend tot een potentiële aantal stamcellen per oog te krijgen. De bollen kunnen dan vervolgens gescheiden worden in losse cellen en gepasseerd om na te gaan zelfvernieuwing mogelijkheden of gedifferentieerd in de verschillende celtypen van de neurale netvlies en RPE het gebruik van verschillende combinaties van groeifactoren en / of eiwitten.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Laura Clarke voor haar onschatbare hulp. Dit werk wordt ondersteund door NCE: Stem Cell Network, CIHR en NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi 2000 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Cold Light Source | Carl Zeiss, Inc. | KL1500 | dual arm optic light |
| Curved Mini Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Angled Vannas scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| #7 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | non-serrated |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | straight |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | serrated curved |
| #3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | |
| #10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Dispase | VWR international | CACB354235 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Kynurenic Acid | Sigma-Aldrich | K3375 | 1000 IU |
| Trypsin Inhibitor | Roche Group | 10109878001 | |
| 35 mm dishes | VWR international | CA354235 | |
| 24-well plate | VWR international | CA73521-004 | |
| Cotton-plugged pipettes | VWR international | 14672-400 | fire-polish |
| 14 mL Tubes | Falcon BD | 352057 | Polystyrene |
| Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | ||
| FGF2 | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 100 IU |
References
- Tropepe, V., Coles, B. L., Chiasson, B. J. Retinal stem cells in the adult mammalian eye. Science. 287, 2032-2036 (2000).
- Ahmad, I., Tang, L., Pham, H. Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye. Biochem Biophys Res Commun. 270, 517-521 (2000).
- Coles, B. L., Angenieux, B., Inoue, T. Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15772-15777 (2004).
- Cicero, S. A., Johnson, D., Reyntjens, S. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 6685-6690 (2009).
- Lamba, D., Karl, M., Reh, T. Neural regeneration and cell replacement: a view from the eye. Cell Stem Cell. 2 (6), 538-549 (2008).
- Coles, B. L., Horsford, D. J., McInnes, R. R., van der Kooy, D. Loss of retinal progenitor cells leads to an increase in the retinal stem cell population in vivo. Eur J Neurosci. 23, 75-82 (2006).
- Angénieux, B., Schorderet, F. D., Arsenijevic, Y. Epidermal growth factor is a neuronal differentiation factor for retinal stem cells in vitro. Stem Cells. 24 (3), 696-706 (2006).
- Xu, S., Sunderland, M. E., Coles, B. L. The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Pax6. Dev Biol. 304, 713-721 (2007).
- Canola, K., Angénieux, B., Tekaya, M., Quiambao, A., Naash, M. I., Munier, F. L., Schorderet, D. F., Arsenijevic, Y. Retinal stem cells transplanted into models of late stages of retinitis pigmentosa preferentially adopt a glial or a retinal ganglion cell fate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 446-4454 (2007).
- Canola, K., Arsenijevic, Y. Generation of cells committed towards the photoreceptor fate for retinal transplantation. Neuroreport. 18 (9), 851-855 (2007).
- Djojosubroto, M. W., Arsenijevic, Y. Retinal stem cells: promising candidates for retina transplantation. Cell Tissue Res. 331 (1), 347-357 (2008).
- Inoue, T., Coles, B. L., Dorval, K., Bremner, R., Bessho, Y., Kageyama, R., Hino, S., Matsuoka, M., Craft, C. M., McInnes, R. R., Tremblay, F., Prusky, G. T., van der Kooy, D. Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells. Stem Cells. 28 (3), 489-500 (2010).
- Tropepe, V., Sibilia, M., Ciruna, B. G., Rossant, J., Wagner, E. F., Kooy, D. vander Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol. , 208-201 (1999).
- Coles-Takabe, B. L., Brain, I., Purpura, K. A., Karpowicz, P., Zandstra, P. W., Morshead, C. M., van der Kooy, D. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
