Summary
In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie Sie retinalen Stammzellen aus dem Ciliarepithels der Maus Auge zu isolieren und zu wachsen sie in Kultur zu klonalen Netzhaut Kugeln zu bilden. Die Kugeln, die isoliert besitzen den Kardinal Eigenschaften von Stammzellen: Selbsterneuerung und multipotentiality.
Abstract
Die erwachsenen Maus retinalen Stammzellen (RSC) ist eine seltene Ruhe Zelle innerhalb der Ciliarepithels (CE) der Säugetier Auge 1,2,3 gefunden. Die CE besteht aus nicht-pigmentierten inneren und pigmentierten äußeren Zellschichten gemacht, und die klonale RSC Kolonien, die aus einem einzigen pigmentierten Zellen aus dem CE entstehen bestehen sowohl aus pigmentierten und nicht pigmentierten Zellen, die unterschieden werden können an alle die Form Zelltypen des neuronalen Netzhaut und des RPE. Es gibt eine Kontroverse darüber, ob alle Zellen innerhalb der Sphären enthalten alle zumindest einige Pigment 4, allerdings sind die Zellen noch in der Lage der Bildung der verschiedenen Zelltypen innerhalb der neuronalen Retina 1-3 gefunden. Bei einigen Arten, wie Amphibien und Fischen sind die Augen der Lage, die Regeneration nach Verletzungen 5 jedoch, das Auge der Säugetiere zeigt keine solche regenerative Eigenschaften. Wir versuchen, die Stammzellen in vivo zu identifizieren und die Mechanismen, die den Säugetieren retinalen Stammzellen Ruhestrom 6-8 zu halten verstehen, auch nach Verletzungen sowie ihre Verwendung als eine potenzielle Quelle von Zellen zu reparieren körperliche oder genetische Modelle von Augenverletzungen Hilfe durch die Transplantation 9-12. Hier beschreiben wir, wie man den Ciliar Epithelzellen aus der Maus Auge zu isolieren und zu wachsen sie in der Kultur, um die klonale retinalen Stammzellen Kugeln zu bilden. Da es keine bekannten Markern der Stammzellen in vivo, sind diese Kugeln die einzige bekannte Möglichkeit, prospektiv identifizieren die Stammzell-Population innerhalb der Ciliarepithels des Auges.
Protocol
1. Bereiten Sie die Dissecting Solutions und Enzymlösungen
- Machen Sie das Künstliche Rückenmarksflüssigkeit (ACSF) und die Serum-freien Medien vor der Zeit und in den Kühlschrank.
- Abwiegen der Kynurensäure (0,2 mg / ml) auflösen und in 10 ml hilo ACSF in einem 37 ° C im Wasserbad vor der Zeit, da es nicht leicht löst.
- Abwiegen der Trypsin (1,33 mg / mL) und Hyaluronidase (0,67 mg / mL) und in einem 15 ml-Röhrchen und bewahren Sie sie bei -20 ° C bis zum Gebrauch. Fügen Sie die Kynurensäure Lösung für dieses Rohr und Filter mit einer 22 um Spritzenfilter kurz vor dem Gebrauch.
- Abwiegen Trypsin Inhibitor (Ovamucoid: 1 mg / mL) und lösen sich in warmen Serum-freien Medien und Filter mit 22μm Spritzenfilter.
- Nehmen Sie die Beschichtung Medien: Serum-freien Medien mit FGF2 (10 ng / mL) und Heparin (2 pg / mL).
2. Isolating Retinal Stammzellen aus der Maus Eye
- Isolation des retinalen Stammzellen ist in einem bestimmten sterilen Raum gewidmet Primärkultur Experimente durchgeführt. Vor Beginn dieser Prozedur richten Sie die Präpariermikroskop und Kaltlichtquelle, und dann legen die sterile Sezierbesteck. Jeder Kapuze hat eine heiße Perle Sterilisator zum Sterilisieren der Instrumente zwischen den Schritten.
- Wir isolieren retinalen Stammzellen aus Augen, die platziert wurden sofort in eine sterile Petrischale mit Artificial Rückenmarksflüssigkeit (ACSF) nach der Entnahme aus Mäuse getötet nach anerkannten Tierethik Protokolle.
- Unter dem Binokular, reinigen Sie die Augen mit einer Pinzette: loszuwerden, die Haare und das Bindegewebe, das die Hornhaut / Sklera Grenze gebunden ist. Dann übertragen Sie den Blick auf ein neues Gericht mit ACSF.
- Während sanft ausspülen, das Auge stationär mit Wellenschliff Pinzette verwenden abgewinkelt Micro-Präparierscheren die Augenmuskeln zu entfernen. Entfernen Sie den Sehnerv sowie, wenn es noch mit dem Auge angebracht. Versuchen Sie nicht, das Auge während dieses Prozesses squish. Transfer Augen für eine neue Platte mit ACSF.
- Als nächstes verwenden gebogenen Mikro-Präparierscheren für das Auge in zwei Hälften geschnitten: begin am Sehnerv und Schnitt durch die Mitte der Hornhaut, Treffen wieder auf den Sehnerv, wo der Schnitt wurde eingeleitet. Es ist ideal, wenn die beiden Teile des Auges entspricht in etwa der Größe sind, weil das macht den nächsten Schritt zu erleichtern.
- Halten Sie die Hornhaut mit zwei Pinzetten vorsichtig schälen die beiden Augen Hälften auseinander. Entfernen und entsorgen Sie das Objektiv, Eingeweide, und die neuronalen Netzhaut des Auges Muscheln. Übertragen Sie die Muscheln auf ein neues Gericht mit ACSF.
- Jetzt sind wir bereit, die Ciliarepithels isolieren. Um zu beginnen, orientieren Auge Schale, so dass die Hornhaut auf der rechten und der retinalen Pigmentepithel (RPE) ist auf der linken Seite. Gently pin Auge Schale unten mit geraden Pinzette auf die RPE Seite.
- Als Nächstes verwenden Sie ein Skalpell, um die Hornhaut und der Iris weggeschnitten aus dem Ciliarepithels des Auges durch leichtes Drücken auf das Skalpell anstatt Sägen Bewegungen.
- Danach schneiden Sie die Ciliarepithels vom RPE. Verwenden Sie nicht gezahnt Pinzette, um den Streifen von Ciliarepithels zu einem neuen 35-mm-Schale mit ACSF übertragen.
- In gleicher Weise isolieren Ciliarepithel aus dem anderen Auge Shell.
- Sobald beide ciliary epithelialen Streifen gesammelt worden sind, übertragen Sie die Streifen in einen 35-mm-Schale mit 2 ml Dispase. Die Schale mit den Streifen in einem 37 ° C Inkubator für 10 Minuten.
- Nach 10 Minuten, übertragen Sie die Streifen aus dem Dispase in eine Schale mit 2 mL der gefilterten Trypsin, Hyaluronidase und Kynurensäure. Die Schale bei 37 ° C für 10 Minuten.
- Nun zu den Präpariermikroskop zurückzukehren. Halten Sie die Sklera unten mit geraden Zangen, verwenden Sie den unteren Rand des gekrümmten nicht gezahnt Pinzette vorsichtig abkratzen Ciliarepithel weg von der Lederhaut.
- Entfernen Sie die Lederhaut aus der Schüssel. Alles, was in der Schale links sollte nun sind die Zellen von Interesse und der Enzymlösung.
- Mit einem feuerpolierte Baumwolle gesteckt Pipette dieser Lösung in einen 14-ml-Tube. Man reibt diese Lösung 30 mal auseinander zu brechen den Epithelzellen durch vorsichtiges zwingt die Lösung in die und aus der Pipette.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen 5 Minuten bei 1500 RPM. Wenn der Zentrifugation ist, entfernen Sie den Schlauch aus der Zentrifuge vorsichtig erfolgen, da die Zellen anfällig für Fahren von den Boden des Röhrchens in diesem Stadium sind.
- Vorsichtig absaugen die Mehrheit der Überstand mit einer Pipette feuerpolierte, und fügen Sie dann 1 ml Trypsin-Inhibitor in serum-freien Medien zu den Zellen. Verwenden Sie eine kleine Bohrung Baumwolle gesteckt Pipette auf die Probe ungefähr 50-mal verreiben, bis es eine Single-Zellsuspension wird.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen wieder für 5 Minuten bei 1500 RPM.
- Entfernen Sie den Überstand und ersetzen Sie es mit 1 mL der Beschichtung Medium. Man reibt vorsichtig mit einem feuerpolierte Glaspipette, die ce resuspendierenlls.
- Nach Auszählung der Zellen, Platte sie auf die gewünschte Dichte in einer 24-Well-Platte. Wir in der Regel Platte 10 Zellen / ul, indem jedes Well zunächst mit Medium und dann die Zellsuspension auf ein Endvolumen von 500 ul Medien zu bekommen.
- Die Platte wird in einem 37 ° C CO 2-Inkubator, wo es nicht verschoben wird, bis Sie die Kugeln, die nach 7 Tagen entstehen zu zählen.
3. Die Ergebnisse der Isolating Retinal Stem Cells
- Wenn diese Prozedur erfolgreich ausgeführt wird, sollte die seziert ciliary Epithelzellen wie diese, nachdem sie dissoziiert und vernickelt bei geringer Dichte (Abbildung 1) zu suchen.
- Nach 7 Tagen in Kultur, sind die retinalen Stammzellen Sphären, die entstehen gezählt. Eine Kugel soll mehr als 75 &mgr; m im Durchmesser und frei schwebende als Stammzellen abgeleitete Kugel gezählt werden. (Abbildung 2). Allerdings werden einige Zellen haben begrenzte Verbreitung und Form Sphäroide, die nicht Größe Kriterium und nicht als Stammzellen abgeleitete Kugeln gezählt werden, ein Beispiel für eine solche Sphäroid ist hier (Abbildung 2) gezeigt.
4. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1.
Abbildung 2.
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt, wie Retina-Stammzellen aus dem Ciliarepithels der Maus Auge 1-3 isolieren. Die Methodik zur Isolierung der Streifen Ciliarepithels kann variieren, aber die Enzyme und die Methodik zur Erzielung einer Single-Zellsuspension wurden in diesem Protokoll optimiert. Es ist auch wichtig, dass die Streifen von Ciliarepithels, die isoliert wurden nicht enthalten große Mengen an RPE oder Hornhaut, da diese offensichtlich einen negativen Einfluss auf die Gesamtzahl der Kugeln, die von jedem Auge isoliert werden müssen. Darüber hinaus wird das Serum-freien Medien, die wir machen, das ursprünglich für die Gehirnentwicklung Neurosphären 13 formuliert, ideal für den Anbau von retinalen Stammzellen Sphären. Man sollte auch darauf achten, dass die Zellen nicht gestört werden, nachdem sie vergoldet worden und in den Inkubator, damit die wachsende Kugeln aggregieren nicht zusammen 14.
Sobald die Netzhaut Stammzellen klonale Kugeln gebildet haben, können sie gezählt, um eine prospektive Anzahl der Stammzellen pro Auge zu bekommen. Die Kugeln dann können dann in einzelne Zellen dissoziiert und passagiert, um festzustellen, Selbst-Erneuerung Fähigkeiten oder differenziert in die verschiedenen Zelltypen des neuronalen Netzhaut und RPE durch verschiedene Kombinationen von Wachstumsfaktoren und / oder Proteinen.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Laura Clarke für ihre unschätzbare Hilfe. Stem Cell Network, CIHR und NIH: Diese Arbeit wird von NCE unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi 2000 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Cold Light Source | Carl Zeiss, Inc. | KL1500 | dual arm optic light |
| Curved Mini Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Angled Vannas scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| #7 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | non-serrated |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | straight |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | serrated curved |
| #3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | |
| #10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Dispase | VWR international | CACB354235 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Kynurenic Acid | Sigma-Aldrich | K3375 | 1000 IU |
| Trypsin Inhibitor | Roche Group | 10109878001 | |
| 35 mm dishes | VWR international | CA354235 | |
| 24-well plate | VWR international | CA73521-004 | |
| Cotton-plugged pipettes | VWR international | 14672-400 | fire-polish |
| 14 mL Tubes | Falcon BD | 352057 | Polystyrene |
| Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | ||
| FGF2 | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 100 IU |
References
- Tropepe, V., Coles, B. L., Chiasson, B. J. Retinal stem cells in the adult mammalian eye. Science. 287, 2032-2036 (2000).
- Ahmad, I., Tang, L., Pham, H. Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye. Biochem Biophys Res Commun. 270, 517-521 (2000).
- Coles, B. L., Angenieux, B., Inoue, T. Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15772-15777 (2004).
- Cicero, S. A., Johnson, D., Reyntjens, S. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 6685-6690 (2009).
- Lamba, D., Karl, M., Reh, T. Neural regeneration and cell replacement: a view from the eye. Cell Stem Cell. 2 (6), 538-549 (2008).
- Coles, B. L., Horsford, D. J., McInnes, R. R., van der Kooy, D. Loss of retinal progenitor cells leads to an increase in the retinal stem cell population in vivo. Eur J Neurosci. 23, 75-82 (2006).
- Angénieux, B., Schorderet, F. D., Arsenijevic, Y. Epidermal growth factor is a neuronal differentiation factor for retinal stem cells in vitro. Stem Cells. 24 (3), 696-706 (2006).
- Xu, S., Sunderland, M. E., Coles, B. L. The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Pax6. Dev Biol. 304, 713-721 (2007).
- Canola, K., Angénieux, B., Tekaya, M., Quiambao, A., Naash, M. I., Munier, F. L., Schorderet, D. F., Arsenijevic, Y. Retinal stem cells transplanted into models of late stages of retinitis pigmentosa preferentially adopt a glial or a retinal ganglion cell fate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 446-4454 (2007).
- Canola, K., Arsenijevic, Y. Generation of cells committed towards the photoreceptor fate for retinal transplantation. Neuroreport. 18 (9), 851-855 (2007).
- Djojosubroto, M. W., Arsenijevic, Y. Retinal stem cells: promising candidates for retina transplantation. Cell Tissue Res. 331 (1), 347-357 (2008).
- Inoue, T., Coles, B. L., Dorval, K., Bremner, R., Bessho, Y., Kageyama, R., Hino, S., Matsuoka, M., Craft, C. M., McInnes, R. R., Tremblay, F., Prusky, G. T., van der Kooy, D. Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells. Stem Cells. 28 (3), 489-500 (2010).
- Tropepe, V., Sibilia, M., Ciruna, B. G., Rossant, J., Wagner, E. F., Kooy, D. vander Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol. , 208-201 (1999).
- Coles-Takabe, B. L., Brain, I., Purpura, K. A., Karpowicz, P., Zandstra, P. W., Morshead, C. M., van der Kooy, D. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
