Summary
このビデオでは、我々はマウスの眼の毛様体上皮から網膜幹細胞を分離し、クローン網膜球体を形成する文化の中で、それらを成長させる方法を紹介します。分離されている球は、幹細胞の枢機卿性質を有している：自己再生および多能。
Abstract
成体マウスの網膜幹細胞（RSC）は、哺乳類の目1,2,3の毛様体上皮（CE）に見られる珍しい静止細胞です。 CEは、非色素内側と色素外側の細胞層から構成され、そしてCEからの単一色素細胞から生じるクローンRSCコロニーはすべて形成するために区別することができます両方の色素と非色素細胞で構成されています神経網膜とRPEの細胞型。球内のすべての細胞はすべて、少なくともいくつかの顔料4を含むかどうかについてのいくつかの論争があり、しかし細胞はまだ1月3日神経網膜内に存在する異なる種類の細胞を形成することができる。このような両生類や魚類などのいくつかの種においては、彼らの目はしかし、怪我の5の後の再生が可能です。哺乳類の目にはそのような再生特性を示していない。我々は、in vivoで幹細胞を識別し、目のけがの修復物理的または遺伝的モデルを助けるために、細胞の潜在的なソースとして使用しているだけでなく、さらに損傷後、6-8静止哺乳類の網膜幹細胞を維持するメカニズムを理解しよう9月12日移植による。ここでは、クローン網膜幹細胞の球体を形成するために、マウスの眼から毛様体上皮細胞を分離し、文化の中で、それらを成長させる方法について説明します。 in vivoで幹細胞の既知のマーカーが存在しないため、これらの球はプロスペクティブに眼の毛様体上皮内に幹細胞集団を識別するための唯一の知られている方法です。
Protocol
1。解剖ソリューションと酵素液を準備する
- 事前に人工脳脊髄液（ACSF）と無血清培地を作成し、冷蔵。
- キヌレン酸（0.2 mg / mL）を秤量し、それが容易に溶解しないので、事前に37℃の水浴中でヒロACSFを10 mLに溶かす。
- トリプシン（1.33 mg / mLの）とヒアルロニダーゼ（0.67 mg / mLの）一、15 mLの試験管内の場所を秤量し、必要になるまで-20℃で保管してください。このチューブにキヌレン酸のソリューションを追加し、使用直前に22μmのシリンジフィルターを使用してフィルタ。
- トリプシンインヒビター（Ovamucoid：1 mg / mL）を秤量し、22μmのシリンジフィルターを使用して暖かい無血清培地とフィルターで溶解する。
- FGF2（10 ng / ml）およびヘパリン（2μg/ mL）を含む無血清培地：メッキのメディアを作成します。
2。マウスの眼から網膜幹細胞を単離する
- 網膜幹細胞の単離は、初代培養の実験に特化した特定の無菌室で行われます。この手順を開始する前に、滅菌解剖器具をレイアウトして解剖顕微鏡と冷光源を設定し、。それぞれのフードには、ステップ間の楽器を滅菌するためのホットビーズ滅菌器を持っています。
- 我々は、承認された動物の倫理のプロトコルに従って屠殺したマウスからそれを除去した後、人工脳脊髄液（ACSF）を含む滅菌ペトリ皿にすぐに配置されている眼から網膜幹細胞を分離します。
- 解剖顕微鏡下で、鉗子で目を洗浄：髪の毛と角膜/強膜の境界線に接続されている結合組織を取り除く。その後、ACSFを使用して新しい料理に目を移す。
- 優しく鋸歯鉗子で固定目を押さえながら、眼筋を除去するために角度付きのマイクロ解剖ハサミを使う。それがまだ目に添付されている場合だけでなく、視神経を削除します。このプロセス中に目をつぶししないようにしてください。 ACSFを使用して新しい料理に目を移す。
- 次の使用は、はさみが半分に目をカットするためのマイクロ解剖湾曲：カットが開始された視神経を振り返っ満たし、角膜の中央を通る視神経とカットから始まります。これは次のステップを容易にするため、眼の2つのサイズがほぼ同等である場合、それは理想的です。
- 離れて2つのアイ半分剥離優しく、二つの鉗子を使用して角膜を開催。レンズ、内臓、および目のシェルから神経網膜を取り外して廃棄。 ACSFで新しい皿にシェルを転送する。
- 今、私たちは、毛様体上皮を分離する準備が整いました。開始するには、東洋の目のシェルでは、その角膜があなたの右と網膜色素上皮（RPE）になっていることを左手にあります。ゆっくりとRPE側のストレートピンセットで目のシェルを突き止める。
- 次に、静かにメスを押し下げはなく、製材の動きを使って、眼の毛様体上皮から角膜と虹彩をカットするためにメスを使用してください。
- その後、離れてRPEから毛様体上皮をカット。 ACSFを含む新しい35 - mmディッシュに毛様体上皮のストリップを転送するために、非鋸歯状の鉗子を使用してください。
- 同じように、他の眼のシェルから毛様体上皮を分離する。
- 両方の毛様体上皮細片を収集したら、ディスパーゼの2 mLを含む、35 mmディッシュにストリップを移す。 10分間、37℃インキュベーターでストリップで皿を置きます。
- 10分後、フィルタ処理されたトリプシン、ヒアルロニダーゼ、およびキヌレン酸2 mLを含む皿にディスパーゼからストリップを転送する。 37皿を置き° Cで10分間。
- 今解剖顕微鏡に戻ります。ストレートピンセットで強膜を押しながら、静かに離れて強膜から毛様体上皮の傷が付かないように湾曲した非鋸歯状の鉗子の底を使用してください。
- 皿から強膜を取り除く。皿に残されるべきものは、現在の関心と酵素液の細胞である。
- ファイアーポリッシュ綿プラグのピペットを使用して、14 mlのチューブにこのソリューションを転送する。ピペットのinとoutソリューションを強制することにより上皮細胞を分解するために、このソリューションを30回ひいて粉にする。
- 1500rpmで5分間、チューブを遠心する。細胞はこの段階でチューブの底を抜けになりやすいので、遠心分離が終了すると、慎重に遠心機からチューブを取り外します。
- ゆっくりとファイアーポリッシュピペットを用いて上清の大部分を吸引し、細胞に無血清培地でトリプシンインヒビターの1 mLを加える。それは、単一細胞懸濁液になるまで、約50倍のサンプルをひいて粉にするために小さな孔綿栓したピペットを使用してください。
- 1500rpmで5分間再びチューブを遠心する。
- 上清を除去し、メッキの培地1mLに交換してください。細胞を再懸濁するためにファイアーポリッシュガラスピペットを用いて軽く砕いて粉にする。
- カウントの後板その24 - ウェルプレートにおける所望の密度で、細胞を優先します。通常我々平板培地で最初のウェルの各項目を入力して、メディアの500μLの最終的な音量を得るために細胞懸濁液を追加することにより、10細胞/μL。
- それはあなたが7日後に発生する球をカウントするまで移動されない37℃CO 2インキュベーターでプレートを置きます。
3。網膜幹細胞を単離するの結果
- この手順が正常に実行されると、解剖毛様体上皮細胞は低密度（図1）で解離し、メッキされた後、次のようになります。
- 培養中の7日後、生じた網膜幹細胞の球がカウントされます。球体は、直径および幹細胞由来の球としてカウントされるフリーフローティングでは75μm以上にしてください。 （図2）。ただし、一部の細胞は大きさの基準を満たしていないと幹細胞由来の球としてカウントされず限られた増殖とフォームの回転楕円体を持つことになります。このような回転楕円体の例は（図2）ここに示されています。
4。代表的な結果
図1。
図2。
Discussion
このプロトコルは1-3マウスの眼の毛様体上皮から網膜幹細胞を分離する方法について説明します。毛様体上皮の細片を単離するための方法論は、しかしながら、単一細胞懸濁液を達成するための酵素と方法論は、このプロトコルに最適化されている、変えることができます。それは、これらは各々の眼から単離することができる球の総数にマイナスの影響を持っているように見えるので、分離されている毛様体上皮のストリップはRPEまたは角膜を大量に含まれていないことも重要です。さらに、我々は、もともとbrainニューロスフェアを13日に策定され、その作成 することを無血清培地は、網膜幹細胞の球を成長させるための理想的です。一つは、また、それらが成長している球が一緒に14を集計しないように播種し、インキュベータ内に配置された後、細胞に障害が発生していないことを確認する必要があります。
網膜幹細胞がクローン性の球を形成した後、それらは眼あたりの幹細胞の見込み数を得るためにカウントすることができます。球体は、その後、単一細胞に解離さと把握自己再生能力に継代または成長因子および/またはタンパク質の異なる組み合わせを使用して神経網膜とRPEの異なる細胞型に分化することができます。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
私たちは、彼女の貴重な援助のためにローラクラークに感謝。幹細胞ネットワーク、CIHRとNIH：この作品は、NCEによってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi 2000 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Cold Light Source | Carl Zeiss, Inc. | KL1500 | dual arm optic light |
| Curved Mini Vannas scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Angled Vannas scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| #7 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11272-30 | non-serrated |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | straight |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | serrated curved |
| #3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | |
| #10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | |
| Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Dispase | VWR international | CACB354235 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Kynurenic Acid | Sigma-Aldrich | K3375 | 1000 IU |
| Trypsin Inhibitor | Roche Group | 10109878001 | |
| 35 mm dishes | VWR international | CA354235 | |
| 24-well plate | VWR international | CA73521-004 | |
| Cotton-plugged pipettes | VWR international | 14672-400 | fire-polish |
| 14 mL Tubes | Falcon BD | 352057 | Polystyrene |
| Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | ||
| FGF2 | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 100 IU |
References
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