Summary
一旦一个基因被确定为潜在的顽固性登革热病毒,它必须进行评估,它在防止病毒感染的蚊子作用。该协议说明登革热的蚊子感染的程度如何,可以检测。成长的文化,膜喂养蚊子人体血液中的病毒,并化验在蚊子中肠病毒滴度的技术演示。
Abstract
这一程序的目的是感染登革热病毒的伊蚊,在实验室条件和研究感染病毒在蚊子的组织水平和动态。该协议是经常用于研究蚊子病毒的相互作用,特别是确定新的宿主因素,能够确定载体能力。在整个实验必须在BSL2实验室进行。类似恶性疟原虫感染,在任何时候都必须佩戴适当的服装,包括手套和白大褂。实验结束后,所接触到的病毒的所有材料需要75%的乙醇,然后再进行正常洗涤漂白处理。需要抛弃他们之前蒸压的所有其他材料。
Protocol
A.传播病毒在C6/36细胞线。
- 细胞生长至80%,在75 厘米 2烧瓶汇合;
- 删除3-4毫升的容量瓶中剩余的媒体;
- 取0.5毫升股票病毒,到上述单元格中添加1.5%细胞的病毒颗粒的多重感染。慢慢地在室温下摇晃15分钟烧瓶。
- 5%CO 2和37 ° C孵育45分钟
- 添加30毫升的媒体,孵育5天。
B.准备病毒和血液的混合物
- 用刮板的细胞分离,细胞和媒体转移到50 ml锥形管;
- 离心10分钟;在800克收集上清液,细胞沉淀,但保留上清1毫升;
- 冻结上述细胞沉淀在干燥的CO 2,然后在37℃水浴,重复两到三次中解冻;
- 800克为10分钟,离心取上清液,并结合从第3步收集上清;
- 收集与编制配子体文化感染与恶性疟原虫的按蚊蚊子相同的步骤(步骤3)整个人类的血液;
- 结合上述整个人体血液中病毒从第4步上清的平等,并加入人血清(整个体积的10%)。
- 30分钟,在37℃水浴孵育上述混合物对人体血液和登革热病毒
C.喂养蚊子
此过程一直在恶性疟原虫在蚊子感染的部分描述几乎是相同的。在第7天,我们检测肠病毒感染,吸血后第14天的唾液感染。在与病毒接触的所有材料的处理,首先用75%乙醇,然后用10%漂白粉。
D.含量的蚊子组织中的病毒滴度
- 蚊子组织清扫术前两三天,增长C6/36细胞在24孔板的细胞达到80%,在检测时进行一天的汇合;
- 蚊子麻醉在4 ° C时,75%的乙醇浸泡1分钟,无菌牺牲浮出水面。蚊子肠或唾液腺解剖解剖显微镜下用无菌水冲洗,前两次。在此步骤中,所有下面的程序需要在无菌的环境,如生物安全柜中进行。这些组织被转移到管内含有150μL媒体和匀浆一个Kontes颗粒杵电机为90秒;
- 10匀浆液加入到990μL媒体1:100稀释;
- 使进一步的1:10,1:100和1:1000稀释介质,在96孔板;
- 媒体在24孔板中删除,并添加100μL上述四个稀释,每年每个相应的井;
- 板块缓慢摇动15分钟,在室温下孵育45分钟,然后在5%,CO 2和37℃;
- methycellulose叠加(1%)加1ml到每口井;
- 板在37 ° C的5%的CO 2为5天;
- 从这里开始的步骤并不需要无菌的环境,但应在任何时候都采取与任何其他的病原体护理。丢弃从每个板块methycellulose覆盖和污点去除多余媒体
- 添加甲醇/丙酮固定液(1:1)1ml到每口井。在4 ° C为1小时保持;
- 倒掉固定液,用1X PBS清洗一次;
- 1:1000稀释的5%烂醉的对抗病毒的抗体;
- 200μL稀释高免液添加到每个井,37孵育° C为1小时;
- 删除高免1 × PBS液和洗板
- 准备在5%烂醉的(5G脱脂牛奶100毫升为1 × PBS)1:1000稀释的羊抗鼠共轭(嘉里建设猫#074-1806),然后每孔加入200μl,孵育37℃1小时;
- 准备基板如下:1 3' -二氨基terrahydrochloride片剂(西格玛猫#D5905),添加20毫升1 × PBS,溶解后,再加入8μL30%的氢过氧化物酶
- 每孔加入200μL上述基板。让我们在室温下站10分钟
- 取出的基材,并停止加入蒸馏水1ml到每口井的反应
- 倒入水和杂交板干
- 计数的病毒粒子
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Incubator | with 5% CO2, 37oC | |||
50 ml conical tubes | plastic | |||
human serum and blood | O+ | |||
pipette tip | for tissue culture | |||
pipettman | ||||
Pasteur pipetts | glass, sterile | |||
water bath | 37C | |||
centrifuge | ||||
parafilm | ||||
circulating water bath | ||||
glass membrane feeders | with rubber tubing to fit feeders | |||
mosquito cups | ||||
75% ethanol | ||||
10% bleach | ||||
Tissue-culture plates | 6-well, 24-well and 96-well plates | |||
Petri dish | glass | |||
Slides | ||||
fine-tip forceps | ||||
PBS | 1X, sterile | |||
dissecting microscope | Microscope | |||
C6/36 cells | cells | For virus propagation | ||
C6/36 medium | MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin. | |||
3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | 1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 μl of 30% hydrogen peroxidase | |
30% hydrogen peroxidase | ||||
A. aegypti | Animal | mosquito |