Summary
Zodra een gen is geïdentificeerd als potentieel refractaire voor het dengue virus moet worden geëvalueerd voor zijn rol in het voorkomen van virale infecties in de mug. Dit protocol illustreert hoe de mate van dengue infecties van muggen kunnen worden getest. De technieken voor het groeien van het virus in de cultuur, membraan voeden muggen menselijk bloed, en het testen van virale titers in de mug middendarm worden gedemonstreerd.
Abstract
Het doel van deze procedure is om de Aedes mug te besmetten met dengue virus in een laboratorium conditie en de infectie niveau en de dynamiek van het virus in de mug weefsel te onderzoeken. Dit protocol wordt routinematig gebruikt voor het bestuderen van muggen-virus interacties, in het bijzonder voor de identificatie van nieuwe gastheer factoren die in staat zijn om vector competentie te bepalen. Het hele experiment moet worden uitgevoerd in een BSL2 laboratorium. Vergelijkbaar met Plasmodium falciparum infectie, moet de juiste kleding inclusief handschoenen en een labjas gedragen worden te allen tijde. Na het experiment, al het materiaal dat in contact kwam met het virus moeten worden behandeld met 75% ethanol en gebleekt voordat u verder gaat met normaal wassen. Alle andere materialen moeten worden geautoclaveerd voordat weggooien hen.
Protocol
A. Het uitdragen van het virus in de C6/36 cellijn.
- Cellen groeien naar 80% confluentie in 75 cm 2 fles;
- Verwijder de media met 3-4 ml in de kolf resterende;
- Neem 0,5 ml bouillon virus en toe te voegen in de bovenstaande cel met de multipliciteit van infectie van 1,5 virusdeeltjes per cel. Schudden de kolf gedurende 15 minuten langzaam op de kamer temperatuur.
- Incubeer gedurende 45 minuten bij 5% CO 2 en 37 ° C
- Voeg 30 ml media, en incubeer gedurende 5 dagen.
B. Maak het mengsel van het virus en bloed
- Maak de cel met de schraper en overdracht van de cel en media om de 50 ml conische buizen;
- Centrifugaat bij 800g gedurende 10 minuten, verzamel de bovenstaande vloeistof, maar laat 1 ml supernatant met de celpellet;
- Bevriezing van de bovenstaande cel pellet in droge CO 2 en daarna dooi in de 37 ° C waterbad, herhaalt u twee tot drie keer;
- Centrifugaat bij 800g gedurende 10 minuten, neem de supernatant, en combineren met het supernatant verzameld uit stap 3;
- Verzamel volledig menselijk bloed met dezelfde procedure (stap 3) voor de voorbereiding van gametocyt cultuur Anopheles mug met Plasmodium falciparum infecteren;
- Combineer de gelijke hoeveelheid van de hierboven menselijk bloed met virus supernatant uit stap 4, en voeg menselijk serum (10% van de totale volume).
- Incubeer het bovengenoemde mengsel van bloed en dengue virus gedurende 30 minuten bij 37 ° C waterbad
C. Feeding muggen
Deze procedure is vrijwel identiek aan wat zijn beschreven in de sectie voor Plasmodium falciparum-infecties in muggen. We assay de middendarm infectie op dag 7, en het speeksel infectie op dag 14 na het bloed geven. Al het materiaal dat in contact kwam met het virus worden eerst behandeld met 75% ethanol en vervolgens met 10% bleekwater.
D. Assay het virus titer in mug weefsel
- Twee of drie dagen voor de dissectie van muggen weefsel, groeien C6/36 cel in een 24 wells plaat zodanig dat de cel 80% confluentie op de dag waarop de test wordt uitgevoerd bereiken;
- Muggen zijn verdoofd bij 4 ° C, geofferd en dook steriel door het weken ze in 75% ethanol gedurende 1 minuut. Dan muggen werden gewassen met steriel water twee keer eerder dissectie van middendarm of speekselklier onder het ontleden microscoop. Vanaf deze stap, al de onderstaande procedure dient te worden uitgevoerd in een steriele omgeving, zoals een biologische veiligheid kast. Deze weefsels worden overgebracht naar een buis die 150 ul media en gehomogeniseerd met een Kontes pellet stamper motor gedurende 90 seconden;
- Maak een 1:100 verdunning door toevoeging van 10 ul van het homogenaat in 990 ul media;
- Maak nog eens 1: 10, 1:100 en 1:1000 verdunning met het medium in de 96 wells-plaat;
- Verwijder de media in de 24 wells plaat, en voeg 100 ul van elk van de vier bovengenoemde verdunningen aan elk overeenkomstige goed;
- Langzaam Schud de plaat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, vervolgens incubeer gedurende 45 minuten bij 5% CO 2 en 37 ° C;
- Voeg 1 ml methycellulose overlay (1%) aan elk putje;
- Incubeer de platen bij 37 ° C met 5% CO 2 gedurende 5 dagen;
- De stappen van de hier niet nodig een steriele omgeving, maar zoals bij elke andere pathogenen zorg moeten worden genomen ten alle tijden. Gooi methycellulose overlay van elk bord en dep om overtollige media te verwijderen
- Voeg 1 ml methanol / aceton fixatief (1:1) aan elk putje. Bewaren bij 4 ° C gedurende 1 uur;
- Giet het fixeermiddel, en was een keer met 1X PBS;
- Maak 1:1000 verdunning aan het primaire antilichaam tegen het virus met 5% dronken;
- Voeg 200 ul van verdund hyperimmuun vocht aan elke well, incuberen bij 37 ° C gedurende 1 uur;
- Verwijder hyperimmuun vocht en wassen plaat met een X PBS
- Bereid een 1:1000 verdunning van geit anti-muis conjugaat (KPL Cat # 074 tot 1806) in 5% dronken (5g poedervorm afgeroomde melk in 100 ml van een X PBS), en vervolgens 200 ul toe te voegen aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur;
- Bereid ondergrond als volgt: voeg 1 tablet van 3'-diaminobenzidine terrahydrochloride (Sigma Cat # D5905) in 20 ml van een X PBS, na opgelost, en voeg vervolgens 8 ul van 30% waterstof peroxidase
- Voeg 200 ul van de bovenstaande substraat in elk putje. Laten staan bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten
- Verwijder de ondergrond en stop reactie door het toevoegen van 1 ml gedestilleerd water toe aan elk putje
- Giet het water en dep platen te drogen
- Tel de virusdeeltje
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | with 5% CO2, 37oC | |||
| 50 ml conical tubes | plastic | |||
| human serum and blood | O+ | |||
| pipette tip | for tissue culture | |||
| pipettman | ||||
| Pasteur pipetts | glass, sterile | |||
| water bath | 37C | |||
| centrifuge | ||||
| parafilm | ||||
| circulating water bath | ||||
| glass membrane feeders | with rubber tubing to fit feeders | |||
| mosquito cups | ||||
| 75% ethanol | ||||
| 10% bleach | ||||
| Tissue-culture plates | 6-well, 24-well and 96-well plates | |||
| Petri dish | glass | |||
| Slides | ||||
| fine-tip forceps | ||||
| PBS | 1X, sterile | |||
| dissecting microscope | Microscope | |||
| C6/36 cells | cells | For virus propagation | ||
| C6/36 medium | MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin. | |||
| 3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | 1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 μl of 30% hydrogen peroxidase | |
| 30% hydrogen peroxidase | ||||
| A. aegypti | Animal | mosquito |
