Protokoll für Dengue-Infektionen in Mücken (Aedes aegypti) und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung

Summary

Sobald ein Gen als potentiell feuerfesten für die Dengue-Virus identifiziert ist, muss er für seine Rolle bei der Verhinderung virale Infektionen innerhalb der Mücke ausgewertet werden. Dieses Protokoll zeigt, wie das Ausmaß der Dengue-Infektionen von Mücken getestet werden kann. Die Techniken für den Anbau bis das Virus in Kultur-, Membran-Fütterung Moskitos menschlichem Blut und Testen von viralen Titer in der Mücke Mitteldarm demonstriert.

Abstract

Der Zweck dieses Verfahrens ist es, die Aedes Mücke mit Dengue-Virus zu infizieren in einem Labor untersuchen Zustand und die Infektion Niveau und Dynamik des Virus in der Mücke Gewebe. Dieses Protokoll wird routinemäßig zur Untersuchung von Moskito-Virus-Interaktionen, insbesondere für die Identifizierung neuer Host Faktoren, die in der Lage, Vektor-Kompetenz bestimmen werden. Der gesamte Versuch ist nach einem BSL2 Labor durchgeführt werden. Ähnlich wie bei Plasmodium falciparum-Infektionen, müssen angemessene Kleidung einschließlich der Handschuhe und Kittel jederzeit getragen werden. Nach dem Experiment, müssen alle Materialien, die in Kontakt mit dem Virus kam mit 75% Ethanol und gebleicht, bevor Sie mit normalem Waschen behandelt werden. Alle anderen Materialien müssen vor der Entsorgung zu autoklavieren.

Protocol

A. Propagate das Virus in den C6/36 Zelllinie.

1. Zellen wachsen zu 80% Konfluenz in 75 cm ^2-Kolben;
2. Entfernen Sie die Medien mit 3-4 ml im Kolben verbliebene;
3. Nehmen Sie 0,5 ml Lager Virus und fügen in die obige Zelle mit der Multiplizität der Infektion von 1,5 Viruspartikeln pro Zelle. Schütteln der Flasche für 15 Minuten langsam auf Raumtemperatur.
4. Inkubieren für 45 Minuten bei 5% CO ₂ und 37 ° C
5. 30 ml Medien und Inkubation für 5 Tage.

B. Vorbereiten der Mischung von Virus und Blut

1. Lösen Sie die Zelle mit dem Schaber und übertragen Sie die Zelle und Medien, um die 50 ml konische Röhrchen;
2. Zentrifugat bei 800g für 10 Minuten; den Überstand, aber lassen Sie 1 ml Überstand mit dem Zellpellet;
3. Frieren Sie den oben Zellpellet in trockenen CO ₂ und dann Tauwetter in den 37 ° C Wasserbad, wiederholen zwei vor drei Mal;
4. Zentrifugat bei 800g für 10 Minuten, nehmen Sie den Überstand und verbinden sich mit dem Überstand aus Schritt 3 gesammelt;
5. Sammeln menschlichem Vollblut mit dem gleichen Verfahren (Schritt 3) für die Herstellung von gametocyte Kultur Anopheles-Mücke mit Plasmodium falciparum infiziert;
6. Kombinieren Sie die gleiche Menge der oben menschlichem Vollblut mit dem Virus Überstand aus Schritt 4, und fügen menschlichem Serum (10% des gesamten Volumens).
7. Inkubieren Sie die obige Mischung von menschlichem Blut und Dengue-Virus für 30 Minuten bei 37 ° C Wasserbad

C. Fütterung Moskitos

Dieses Verfahren ist nahezu identisch zu dem, was in dem Abschnitt für Plasmodium falciparum-Infektionen in Mücken beschrieben worden. Wir Assay Mitteldarm Infektion an Tag 7, und der Speichel-Infektion an Tag 14 nach Blut-Fütterung. Alle Materialien, die in Kontakt mit dem Virus kam zunächst mit 75% Ethanol und dann mit 10% Bleichmittel behandelt.

D. Assay der Virustiter in Mücke Gewebe

1. Zwei oder drei Tage vor dem Sezieren von Moskito Gewebe wachsen C6/36 Zellen in einer 24-Well-Platte, so dass die Zelle 80% Konfluenz am Tag, wenn der Test durchgeführt wird erreicht;
2. Moskitos sind bei 4 ° C betäubt, getötet und tauchte sterile durch Einweichen in 75% Ethanol für 1 Minute. Dann Mücken wurden mit sterilem Wasser zweimal, bevor Dissektion der Mitteldarm oder Speicheldrüse unter dem Binokular gewaschen. Von diesem Schritt muss alle Schritte aus, um in einer sterilen Umgebung wie eine biologische Sicherheitswerkbank durchgeführt werden. Diese Gewebe werden in ein Röhrchen mit 150 ul Medium übertragen und homogenisiert mit einem Kontes Pellet Pistill Motor für 90 Sekunden;
3. Machen Sie eine 1:100 Verdünnung durch Zugabe von 10 ul des Homogenat in 990 ul Medien;
4. Machen Sie weiter 1: 10, 1:100 und 1:1000 Verdünnung mit dem Medium in der 96-Well-Platte;
5. Entfernen Sie die Medien in den 24-Well-Platte und 100 ul von jedem der vier oben genannten Verdünnungen auf die jeweils gut;
6. Schütteln Sie die Platte langsam für 15 Minuten bei Raumtemperatur, dann 45 Minuten bei 5% CO ₂ inkubiert und 37 ° C;
7. 1ml von methycellulose Overlay (1%) in jede Vertiefung;
8. Die Platten bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für 5 Tage;
9. Die Schritte von hier aus benötigen keine sterile Umgebung, sondern wie bei jedem anderen Erreger Pflege muss jederzeit berücksichtigt werden. Discard methycellulose Overlay von jeder Platte und Blot, um überschüssige Medien entfernen
10. Add 1 ml Methanol / Aceton Fixativ (1:1) in jede Vertiefung. Halten Sie bei 4 ° C für 1 Stunde;
11. Abgießen Fixativ, und waschen Sie einmal mit 1X PBS;
12. Machen 1:1000 Verdünnung an den primären Antikörper gegen das Virus mit 5% blotto;
13. Add 200 ul verdünnt hyperimmune Flüssigkeit in jede Vertiefung, bei 37 ° C inkubieren für 1 Stunde;
14. Entfernen hyperimmune Flüssigkeit und waschen Teller mit 1 X PBS
15. Bereiten Sie eine 1:1000 Verdünnung von Ziegen-anti-Maus-Konjugat (KPL Cat # 074-1806) in 5% blotto (5g Magermilchpulver in 100 ml 1 X PBS), und fügen Sie dann 200 ul in jede Vertiefung und inkubieren 37 ° C für 1 Stunde;
16. Bereiten Substrat wie folgt: Fügen Sie 1 Tablette 3'-Diaminobenzidin terrahydrochloride (Sigma Cat # D5905) in 20 ml 1 X PBS nach aufgelöst, und fügen Sie dann 8 ul von 30% Wasserstoffperoxidase
17. Geben Sie 200 ul der oben genannten Substrat in jede Vertiefung. Stehen lassen bei Raumtemperatur für 10 Minuten
18. Entfernen Substrat und Stop-Reaktion durch Zugabe von 1 ml destilliertem Wasser in jede Vertiefung
19. Abgießen und Blot-Platten zum Trocknen
20. Zählen Sie die Viruspartikel

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Incubator				with 5% CO2, 37oC
50 ml conical tubes				plastic
human serum and blood				O+
pipette tip				for tissue culture
pipettman
Pasteur pipetts				glass, sterile
water bath				37C
centrifuge
parafilm
circulating water bath
glass membrane feeders				with rubber tubing to fit feeders
mosquito cups
75% ethanol
10% bleach
Tissue-culture plates				6-well, 24-well and 96-well plates
Petri dish				glass
Slides
fine-tip forceps
PBS				1X, sterile
dissecting microscope	Microscope
C6/36 cells	cells			For virus propagation
C6/36 medium				MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin.
3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride		Sigma-Aldrich	D5905	1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 μl of 30% hydrogen peroxidase
30% hydrogen peroxidase
A. aegypti	Animal			mosquito