Summary
遺伝子は、デング熱ウイルスのための潜在的に耐火として識別されると、それは蚊の中でウイルス感染の予防にその役割を評価する必要があります。このプロトコルは、蚊のデング熱感染症の程度をアッセイする方法を示します。文化、膜の給餌蚊、ヒト血液中にウイルスが育ち、そして蚊の中腸におけるウイルス力価を測定するための技術が実証されています。
Abstract
この手順の目的は、実験室条件でのデング熱ウイルスにヒトスジシマカの蚊に感染し、蚊の組織の感染レベルやウイルスのダイナミックを検討することである。このプロトコルは、定期的に、特にベクトルの能力を決定することができる新たな宿主因子の同定のために、蚊のウイルスの相互作用を研究するために使用されます。全体の実験は、BSL2実験室で行われなければならない。熱帯熱マラリア原虫の感染症と同様に、手袋と白衣を含む適切な服装を常に着用する必要があります。実験後は、ウイルスと接触したすべての材料は通常の洗濯を始める前に、75％エタノールと漂白で処理する必要があります。他のすべての材料は廃棄それらの前にオートクレーブ処理する必要があります。
Protocol
A.は、C6/36細胞株にウイルスを伝播します。
- 細胞は75 cm 2でフラスコに80％コンフルエントに成長する。
- フラスコ内に残っている3〜4ミリリットルで、メディアを削除する。
- 0.5mlの株式のウイルスを取り出し、細胞あたり1.5ウイルス粒子の感染多重度で、上記のセルに追加します。徐々に室温で15分間フラスコを振とう。
- 5％CO 2、37℃で45分間インキュベート
- 30mlのメディアを追加し、5日間インキュベートする。
B.は、ウイルスと血液の混合物を準備する
- スクレーパーで細胞をデタッチし、50 mLコニカルチューブに細胞とメディアを転送する。
- 上清を収集するが、細胞ペレットと上清1mlのまま、10分間、800グラムでCentrifugate。
- ℃の水浴、繰り返し2〜3倍の37に解凍し乾燥したCO 2に、上記の細胞ペレットを凍結し、
- 上清を取り、ステップ3から採取した上清と結合して、10分間800グラムでCentrifugate。
- 熱帯熱マラリア原虫を持つハマダラカ蚊を感染させるために生殖母細胞培養の調製のための同じ手順（ステップ3）でのヒト全血を集める。
- ステップ4からウイルス上清を上記のヒト全血の同量を組み合わせて、ヒト血清を（全体の体積の10％）を追加。
- 37℃の水浴で30分間ヒト血液およびデングウイルスの上記混合物をインキュベート
C.の餌付けの蚊
この手順では、蚊の熱帯熱マラリア原虫感染症のセクションで説明されているものとほとんど同じです。吸血後14日目7日目、および唾液感染で我々は、アッセイ中腸感染症を。ウイルスと接触して来たすべての材料は、75％エタノールで、次に10％の漂白剤との最初の扱われます。
D.アッセイ蚊組織におけるウイルス力価
- 二、三日蚊の組織解剖前に、細胞はアッセイが行われる日で80％コンフルエントに達するように24ウェルプレートでのC6/36細胞を成長させる。
- 蚊は4で麻酔℃で1分間75％エタノールでそれらを浸すことによって犠牲と滅菌表面C、。その後、蚊は、解剖顕微鏡下で腸や唾液腺の解剖前に二度滅菌水で洗浄した。このステップからは、以下のすべての手順は、このような生物学的安全キャビネットのような無菌環境で実施する必要があります。これらの組織は、150μlの培地を含む試験管に移し、90秒間Kontesペレット乳棒モーターでホモジナイズされています。
- 990μLのメディアにホモジネートの10μlを添加することにより100倍希釈液を加えます。
- さらに1を確認：10、1:100と96ウェルプレートの培地で1:1000希釈;
- 24ウェルプレートでメディアを取り出し、それぞれの対応するウェルに上記の4つの希釈液の各々の100μlを加える。
- その後、5％で45分間インキュベートし、室温で15分間ゆっくりプレートを振るCO 2、37 ° C;
- 各ウェルにmethycelluloseオーバーレイ（1％）の1mlを追加します。
- 37プレートをインキュベート℃で5日間、5％CO 2で。
- ここから無菌環境を必要としない上に、任意の他の病原体のケアと同様のステップは常に注意が必要です。各プレートからmethycelluloseのオーバーレイを破棄し、余分なメディアを削除するには汚点
- 各ウェルにメタノール/アセトン固定液（1:1）を1mlを追加。 1時間4℃でおいてください。
- 固定液を捨て、そして1X PBSで1回洗浄する。
- 5パーセントへべれけとウイルスに対する一次抗体に1:1000希釈を行う。
- 37℃でインキュベート、各ウェルに希釈した高度免疫液200μlを加え℃で1時間のためのC;
- 高度免疫体液を削除し、1 × PBSでプレートを洗浄
- 5パーセントへべれけ（1 X PBSを100mlの5グラム脱脂粉乳）でヤギ抗マウス共役（KPLカタログ番号074〜1806）の1:1000希釈を準備し、各ウェルに200μlを加える、とでインキュベート1時間37 ° C;
- 次のように基板を準備する：溶解後、1 X PBSの20ml中の3' -ジアミノベンジジンterrahydrochloride（Sigmaカタログ＃D5905）の1錠を追加し、次に30％過酸化水素ペルオキシダーゼの8μlを追加する
- 各ウェルに上記基板の200μlを追加。 10分間室温で放置
- 基板を取り外し、各ウェルに蒸留水を1mlを加えて反応を停止
- 乾燥して水とブロットプレートを捨て、
- ウイルス粒子を数える
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | with 5% CO2, 37oC | |||
| 50 ml conical tubes | plastic | |||
| human serum and blood | O+ | |||
| pipette tip | for tissue culture | |||
| pipettman | ||||
| Pasteur pipetts | glass, sterile | |||
| water bath | 37C | |||
| centrifuge | ||||
| parafilm | ||||
| circulating water bath | ||||
| glass membrane feeders | with rubber tubing to fit feeders | |||
| mosquito cups | ||||
| 75% ethanol | ||||
| 10% bleach | ||||
| Tissue-culture plates | 6-well, 24-well and 96-well plates | |||
| Petri dish | glass | |||
| Slides | ||||
| fine-tip forceps | ||||
| PBS | 1X, sterile | |||
| dissecting microscope | Microscope | |||
| C6/36 cells | cells | For virus propagation | ||
| C6/36 medium | MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin. | |||
| 3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | 1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 μl of 30% hydrogen peroxidase | |
| 30% hydrogen peroxidase | ||||
| A. aegypti | Animal | mosquito |
