Summary
Как только ген определены как потенциально огнеупорные для вируса денге, он должен быть оценен для его роль в профилактике вирусных инфекций в комара. Этот протокол иллюстрирует, как степень инфицирования денге комаров могут быть проанализированы. Методы для посадки у вируса в культуре, мембранные кормления комаров человеческой крови, и опробование вирусные титры в комара кишки демонстрируются.
Abstract
Целью этой процедуры является заразить комаров Aedes с вируса денге в лабораторных условиях и изучить уровень инфекции и динамика вируса в организме комара тканей. Этот протокол широко используется для изучения комаров вирус взаимодействия, особенно для идентификации новых факторов хозяина, которые способны определить вектор компетенции. Весь эксперимент должен проводиться в лаборатории BSL2. Как и Plasmodium тропической инфекции, соответствующая одежда, включая перчатки и халат следует носить в любое время. После эксперимента все материалы, которые были в контакте с этим вирусом, должны рассматриваться с 75% этанола и беленой прежде чем приступить к нормальной стирки. Все остальные материалы должны обрабатываться в автоклаве, прежде чем выбросить их.
Protocol
А. Распространить вирус в C6/36 клеточной линии.
- Клетки растут на 80% слияния в 75 см 2 колбы;
- Удалить средах с 3-4 мл, оставшихся в колбу;
- Возьмите 0,5 мл фондовом вирусов и добавить в выше ячейки с множественностью заражения 1,5 вирусных частиц в клетку. Встряхивания колбы в течение 15 минут медленно при комнатной температуре.
- Инкубировать 45 минут при 5% СО 2 и 37 ° C
- Добавить 30 мл средствах массовой информации, и выдержать в течение 5 дней.
Б. Подготовка смеси вируса и крови
- Отсоедините ячейки с скребок и передачи ячейки и СМИ 50 мл конические пробирки;
- Центрифугата на 800 г в течение 10 минут; собирают супернатант, но оставить 1 мл надосадочной с осадок клеток;
- Стоп выше осадок клеток в сухом CO 2, а затем оттепель в 37 ° С водяной бане, повторить два-три раза;
- Центрифугата на 800 г в течение 10 минут, принимать супернатант, и в сочетании с надосадочной собранных с шага 3;
- Сбор цельной человеческой крови с той же процедурой (шаг 3) для подготовки гаметоцит культуры инфицировать малярийных комаров с Plasmodium тропической;
- Смешайте равное количество выше цельной человеческой крови с вирусом супернатант с шага 4, а также добавить сыворотке крови человека (10% от всего объема).
- Инкубируйте выше смесь крови человека и вируса денге в течение 30 минут при 37 ° С водяной бане
Комаров С. Кормление
Эта процедура почти идентична той, что были описаны в разделе Plasmodium инфекций в тропической комаров. Мы анализа кишки инфекции на 7 день, и слюнных инфекции на 14 день после того, питающимися кровью. Все материалы, которые были в контакте с вирусом рассматриваются сначала с 75% этанола, а затем с 10% гипохлоритом натрия.
Д. Анализ титра вируса в тканях комара
- Два или три дня до рассечения тканей комара, растут C6/36 ячейки в 24-луночный планшет так, что клетка достигает 80% слияния в день, когда анализ проводится;
- Комары анестезии при 4 ° С, жертвы и всплыли стерильной путем замачивания их в 75% этаноле в течение 1 минуты. Затем комаров промывали стерильной водой дважды, прежде чем рассечения кишки или слюнных желез при вскрытии микроскопом. С этого шага все ниже процедуру необходимо проводить в стерильных условиях, таких как биологические кабинета безопасности. Эти ткани переданы пробирку, содержащую 150 мкл СМИ и гомогенизировали с Kontes гранул пестиком двигателя в течение 90 секунд;
- Сделать 1:100 разбавления путем добавления 10 мкл гомогената в 990 мкл средствах массовой информации;
- Сделайте еще 1: 10, 1:100 и 1:1000 разбавления среды в 96 ячейках;
- Удалить средств массовой информации в 24-луночный планшет, и добавьте 100 мкл каждого из этих четырех разведениях к каждому из которых соответствует хорошо;
- Встряхните пластины медленно в течение 15 минут при комнатной температуре, затем инкубировать 45 минут при 5% СО 2 и 37 ° С;
- Добавить 1 мл methycellulose наложения (1%) в каждую лунку;
- Инкубируйте пластин при 37 ° C с 5% CO 2 в течение 5 дней;
- Шагах отсюда на не требующие стерильных условиях, а как с любой другой возбудитель следует проявлять осторожность во все времена. Отменить methycellulose наложения друг от пластины и промокните, чтобы удалить излишки средства массовой информации
- Добавить 1 мл метанола / ацетон фиксатором (1:1) в каждую лунку. Хранить при температуре 4 ° С в течение 1 ч;
- Вылейте фиксатора, и мыть один раз 1X PBS;
- Сделать 1:1000 разбавления до первичного антитела против вируса с 5% пьяный;
- Добавьте 200 мкл разведенной гипериммунных жидкости в каждую лунку, инкубировать при температуре 37 ° С в течение 1 ч;
- Удалить гипериммунных жидкость и промыть пластины с 1 х PBS
- Подготовка 1:1000 разбавления антимышиного сопряжены (КПЛ Cat # 074-1806) в 5% одурманенный (5 г порошкообразного обезжиренное молоко в 100 мл 1 х PBS), а затем добавить 200 мкл в каждую лунку и инкубировать в 37 ° С в течение 1 ч;
- Подготовка субстрата следующим образом: добавить по 1 таблетке 3 'диаминобензидина terrahydrochloride (Sigma Cat # D5905) в 20 мл 1 х PBS, после растворения, а затем добавить 8 мкл 30% водорода пероксидазой
- Добавить 200 мкл выше субстрата в каждую лунку. Дайте постоять при комнатной температуре в течение 10 минут
- Удалите подложку и остановить реакцию добавлением 1 мл дистиллированной воды в каждую лунку
- Слейте воду и промокните пластин высохнуть
- Граф вирусной частицы
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | with 5% CO2, 37oC | |||
| 50 ml conical tubes | plastic | |||
| human serum and blood | O+ | |||
| pipette tip | for tissue culture | |||
| pipettman | ||||
| Pasteur pipetts | glass, sterile | |||
| water bath | 37C | |||
| centrifuge | ||||
| parafilm | ||||
| circulating water bath | ||||
| glass membrane feeders | with rubber tubing to fit feeders | |||
| mosquito cups | ||||
| 75% ethanol | ||||
| 10% bleach | ||||
| Tissue-culture plates | 6-well, 24-well and 96-well plates | |||
| Petri dish | glass | |||
| Slides | ||||
| fine-tip forceps | ||||
| PBS | 1X, sterile | |||
| dissecting microscope | Microscope | |||
| C6/36 cells | cells | For virus propagation | ||
| C6/36 medium | MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin. | |||
| 3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | 1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 μl of 30% hydrogen peroxidase | |
| 30% hydrogen peroxidase | ||||
| A. aegypti | Animal | mosquito |
