Summary
Это видео демонстрирует общие методы используются для задних Anopheles gambiae в лаборатории. Методы по уходу за лаборатории комаров демонстрируются на всех этапах жизненного цикла организма от личинки до куколки с питающимися кровью взрослых.
Abstract
Этот протокол описывает комаров воспитания в insectary. Insectary номера поддерживается на уровне 28 ° С и ~ 80% влажности, с 12 час. дневной / ночной цикл. Для этой процедуры вам понадобится комаров клетки, 10% стерильный раствор сахарозы, бумажные полотенца, стакан, ватман фильтровальной бумаги, стекла машин, человеческой крови и сыворотки, водяная баня, парафильмом, дистиллированная вода, чистые пластиковые лотки, москитные пищи (описанных ниже), москитные сетки для покрытия лотков, вакуум, и сборной камеры для сбора взрослых.
Protocol
Mosquito пищи:
- Продовольственная: заземленной рыб (Aquaricare). Небольшой щепоткой должна быть добавлена.
- Продовольственная B: заземленной Корм для кошек (Purina). Небольшой щепоткой должна быть добавлена.
- Продовольственная C: корм для кошек (Purina). Две таблетки нужно добавить.
Кровь:
Животные или крови человека может быть использован для заднего комаров. Свежая кровь собирается с помощью шприца и положить в стерильные 15 мл Сокол пробирку, содержащую 1 мл КПИ (антикоагулянт) на каждые 10 мл крови, затем смешивают мягко и центрифугировали при комнатной температуре при 2000 оборотов в минуту в течение 5 мин. Супернатант отбрасывается, заботясь, чтобы удалить слой кровяного сгустка, который содержит другие клетки крови (например, WBC). РБК гранулы затем приостановлено в равном объеме средней RPMI с помощью пипетки, а в дальнейшем мыть в этой среде в три раза. После последней промывки, гранулированный эритроцитов ресуспендируют в равном объеме средней RPMI и хранили при 4 ° С (может храниться в течение 8-10 дней). Непосредственно перед кормлением, РБК (в RPMI) центрифугируют (2000 оборотов в минуту в течение 5 мин) для осаждения вниз клетки и упакованные РБК ресуспендировали в сыворотке крови (O + сыворотки крови человека), чтобы получить 40% гематокрита. Кровь должна храниться при температуре 37 ° C всегда для кормления.
ДЕНЬ 1:
- 3-5 день старого взрослой самки комаров питаются кровью, чтобы отложить яйца.
- Для питания кровью искусственные мембраны (парафильмом) кормление метод используется следующим образом:
- Красные кровяные клетки (см. выше препаратов крови) смешиваются с тепло инактивированной сыворотки, чтобы получить ~ 40% гематокрита (в упаковке РБК 40% и 60% сыворотки). Это добавляется в стекло подачи.
- Питатель соединен с теплой водой рубашку (37 ° С), и размещен на клетку, чтобы позволить доступ комаров к поверхности мембраны.
- Комары могут кормить в течение ~ 30 минут.
ДЕНЬ 3:
- Самки откладывают яйца два дня после того как они питаются кровью. Небольшой бумажный фильтр, завернутые в конической формы помещается в небольшой стакан с дистиллированной водой, убедившись, что фильтровальная бумага становится влажной. Стакан хранится внутри клетки на ночь для комаров, чтобы отложить яйца.
4 день:
- Фильтр документ, содержащий комара яйца помещают в пластиковый лоток с ~ 300 мл дистиллированной воды. Щепотку пищу добавляется в лоток и яйца разрешается люк, чтобы личинки в течение ближайших дней.
ДНИ 5 - 8:
- Растущие личинки питаются каждый день две таблетки пищевых C и контролируется на предмет плотности и численности населения. На восьмой день (5 дневных личинок), личинки населения разбавляется от 1 лоток до ~ 10 лотков, с щепоткой пищевой и две таблетки пищевых C в каждом лотке. (~ 30 мин)
ДНИ 9 - 12:
- Личинки питаются каждый день во время еды С. На 12-й день (9 дневных личинок), замене воды с пресной водой и продовольствием добавляется (щепотку пищевой B и две таблетки пищевых С). Куколки начинает развиваться на данном этапе. Лотки покрыты сетями, чтобы избежать побега взрослых. (~ 8-10 мин)
ДЕНЬ 13 - 15:
Куколки разрешено появляться на взрослых в течение следующих 2 - 3 дня. Продовольственная дается каждый день, чтобы личинки / куколки, тщательно удаляя сети, чтобы избежать побега взрослых.
ДЕНЬ 16:
- Взрослых собираются в клетку через аспиратор подключен к вакуум. Клетка состоит из небольшого 100 мл флакон с хлопковый фитиль, который пропитывается 10% сахарозы (автоклавного) и подкладкой бумажное полотенце на дно, чтобы впитать любого потенциального разлива сахара, которые могут возникнуть во время обработки клетки. (~ 30-40 мин)
ДЕНЬ 17 - 21:
- Взрослые (мужчины и женщины), которые затем хранятся в insectary комнате в течение 4-5 дней, кормили на 10% сахарозы, прежде чем они снова кровь поступает начать следующий цикл. Же комары могут быть использованы, чтобы отложить яйца несколько раз.
- Комаров, которые не нужны для экспериментов или воспитания могут быть убиты, разместив клетку в морозильную камеру. Использоваться лотки и клетки должны быть очищены и сушат, прежде чем они могут быть использованы снова.
ПРИМЕЧАНИЕ: Там могут быть некоторые изменения в метод воспитания комаров и разных лабораториях могут быть разные методы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Food A | Aquaricare | Grounded fish food. A small pinch needs to be added. | ||
| Food B | Purina | Grounded cat food. A small pinch needs to be added. | ||
| Food C | Purina | Cat food. Two tablets needs to be added | ||
| RBC | prepared red blood cells: 40% hematocrit in human serum | |||
| RPMI | Medium | |||
| CPD | anticoagulant | |||
| serum | O+ human serum | |||
| Mosquito feeder | ||||
| parafilm | ||||
| Anopheles gambiae | mosquitos | |||
| 10% sucrose | mosquito food | |||
| insectary |
References
- Bangs, M. J., Soelarto, T., Barodji,, Wicaksana, B. P., Boewono, D. T. Colonization of Anopheles maculatus from Central Java, Indonesia. J Am Mosq Control Assoc. 18, 359-363 (2002).
- Beier, M. S., Beier, J. C., Merdan, A. A., el Sawaf, B. M., Kadder, M. A. Laboratory rearing techniques and adult life table parameters for Anopheles sergentii from Egypt. J Am Mosq Control Assoc. 266, 266-270 (1987).
- Benedict, M. Q. Care and maintenance of anopheline mosquitoes, The molecular biology of disease vectors: A methods manual. Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. , Champman & Hall. London. 3-12 (1997).
- Casanges, A. H., Mcgovran, E. R., Chiles, J. V. Rearing of Anopheles quadrimaculatus Say and Aedes aegypti (L.) in the laboratory. Mosq News. 9, 112-117 (1949).
- Merritt, R. W., Dadd, R. H., Walker, E. D. Feeding behavior, natural food and nutritional relation ships of larval mosquitoes. Annual Rev. Entomol. 37, 349-376 (1992).
- Nasirian, H., Ladonni, H. Artificial bloodfeeding of Anopheles stephensi on a membrane apparatus with human whole blood. J Am Mosq Control Assoc. 22, 54-56 (2006).
- Ng'habi, K. R., John, B., Nkwengulila, G., Knols, B. G., Killeen, G. F., Ferguson, H. M. Effect of larval crowding on mating competitiveness of Anopheles gambiae mosquitoes. Malar J. 30 (4), 49 (2005).
- Stobart, R. H. Factors affecting the control of body volume in the larvae of the mosquitoes Aedes aegypti and Aedes detritus. Edw. J. Exp. Boil. 54, 67-82 (1971).
