Summary
Deze video illustreert de algemene technieken die worden gebruikt aan de achterzijde Anopheles gambiae in het laboratorium. De methoden voor het onderhoud van het laboratorium muggen worden gedemonstreerd in alle stadia van het leven van het organisme cyclus van larven tot poppen om bloed te geven volwassenen.
Abstract
Dit protocol beschrijft mug opvoeding in de insectary. De insectary kamers zijn gehandhaafd op 28 ° C en ~ 80% luchtvochtigheid, met een 12 uur. dag / nacht cyclus. Voor deze procedure moet u mug kooien, 10% steriele sucrose-oplossing, papieren handdoeken, beker, Whatman filter papier, glas feeders, menselijk bloed en serum, waterbad, parafilm, gedestilleerd water, schone plastic trays, mug voedsel (zoals beschreven hieronder), muskietennet aan de trays, vacuüm, en een verzameling afdekklepje voor volwassenen te verzamelen.
Protocol
Mosquito voedsel:
- Eten A: geaarde visvoer (Aquaricare). Een klein snufje moet worden toegevoegd.
- Eten B: geaarde CAT voedsel (Purina). Een klein snufje moet worden toegevoegd.
- Eten C: kattenvoer (Purina). Twee tabletten moet worden toegevoegd.
Het bloed:
Dier of menselijk bloed kan worden gebruikt om achter muggen. Vers bloed is verzameld met een spuit en in een steriele 15 ml Falcon buis met daarin 1 ml van de CPD (antistollingsmiddel) voor elke 10 ml bloed, dan voorzichtig gemengd en gecentrifugeerd bij kamertemperatuur bij 2000 rpm gedurende 5 minuten. Het supernatant wordt verwijderd en zorg ervoor dat de buffy coat, die andere bloedcellen (bijv. WBC) omvat te verwijderen. De RBC-pellet wordt vervolgens gesuspendeerd in een gelijk volume van RPMI medium door pipetteren, en verder gewassen in dit medium drie keer. Na de laatste wasbeurt, het ingehulde RBC zijn geresuspendeerd in een gelijk volume van RPMI medium en opgeslagen bij 4 ° C (kan worden gehouden voor 8-10 dagen). Net voor het voeden, is de RBC (in RPMI) gecentrifugeerd (2000 rpm gedurende 5 minuten) om pellet beneden de cellen, en de verpakte RBC is geresuspendeerd in serum (O + menselijk serum) om een 40% hematocriet te verkrijgen. Het bloed moet worden bewaard bij 37 ° C altijd voor de voeding.
DAG 1:
- De 3-5 dagen oude volwassen vrouwelijke muggen worden gevoed met bloed om eitjes te leggen.
- Voor bloed voeden, is een kunstmatig membraan (parafilm) voeding gebruikte methode als volgt:
- Rode bloedcellen (zie hierboven voor het bloed voorbereiding) worden gemengd met warmte geïnactiveerd serum om een ~ 40% hematocriet (verpakt RBC 40% en serum 60%) te verkrijgen. Dit wordt toegevoegd aan het glas feeder.
- De feeder is verbonden met een warm water-jack (37 ° C), en op de kooi om de muggen de toegang tot het membraanoppervlak mogelijk te maken.
- De muggen mogen voer voor ~ 30 minuten.
DAG 3:
- De vrouwtjes eieren leggen zal twee dagen nadat ze zich voeden met bloed. Een kleine filtreerpapier verpakt in een conische vorm wordt in een klein bekerglas met gedestilleerd water, om ervoor te zorgen dat de filter vochtig papier krijgt. De beker wordt bewaard in de kooi 's nachts voor de muggen om eitjes te leggen.
DAG 4:
- Het filter met de mug eitjes is geplaatst in een plastic bakje met ~ 300 ml gedestilleerd water. Een snuifje van voedsel A wordt toegevoegd aan de bak en de eieren mogen naar larven uitkomen de komende dagen.
Dag 5 - 8:
- Groeiende larven worden gevoed elke dag met twee tabletten van voedsel C en gecontroleerd op dichtheid en de bevolking. Op de achtste dag (5 dagen oud larven), is de larven bevolking verdund van een tray tot ~ 10 trays, met een snufje van voedsel A en twee tabletten van voedsel C in elke lade. (~ 30 min.)
Dag 9 - 12:
- De larven worden gevoed elke dag met voedsel C. Op de 12e dag (9 dagen oud larven), wordt het water vervangen met vers water en voedsel wordt toegevoegd (een snufje van voedsel B en twee tabletten van voedsel C). De poppen begint te ontwikkelen in dit stadium. De trays zijn bedekt met netten om te ontsnappen van de volwassenen te voorkomen. (~ 8-10 minuten)
Dag 13 - 15:
De poppen mogen voor volwassenen ontstaan voor de komende 2 - 3 dagen. Voedsel wordt gegeven elke dag aan de larven / poppen door het zorgvuldig verwijderen van de netto om te voorkomen dat ontsnappen van de volwassenen.
Dag 16:
- De volwassenen worden verzameld in een kooi door middel van een afzuiger aangesloten op vacuüm. De kooi bestaat uit een kleine 100 ml fles met een katoenen lont die doordrenkt is met 10% sucrose (autoclaaf) en een papieren handdoek bekleding op de bodem om alle mogelijke suiker gemorst die kunnen optreden tijdens de kooi behandeling genieten. (~ 30-40 min.)
Dag 17 - 21:
- De volwassenen (zowel mannen als vrouwen) worden vervolgens bewaard in de insectary ruimte voor 4-5 dagen, gevoed met 10% sucrose voordat ze weer bloed gevoed aan de volgende cyclus te beginnen. Hetzelfde muggen kan gebruikt worden om eieren te leggen meer dan eens.
- De muggen die niet nodig zijn voor experimenten of opvoeding kunnen worden gedood door het plaatsen van de kooi in een vriezer. De gebruikte schalen en kooien moeten worden gereinigd en gedroogd voordat ze kunnen opnieuw gebruikt worden.
LET OP: Er kunnen een aantal variaties in de mug houderijsysteem en de verschillende labo's kunnen verschillende technieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Food A | Aquaricare | Grounded fish food. A small pinch needs to be added. | ||
| Food B | Purina | Grounded cat food. A small pinch needs to be added. | ||
| Food C | Purina | Cat food. Two tablets needs to be added | ||
| RBC | prepared red blood cells: 40% hematocrit in human serum | |||
| RPMI | Medium | |||
| CPD | anticoagulant | |||
| serum | O+ human serum | |||
| Mosquito feeder | ||||
| parafilm | ||||
| Anopheles gambiae | mosquitos | |||
| 10% sucrose | mosquito food | |||
| insectary |
References
- Bangs, M. J., Soelarto, T., Barodji,, Wicaksana, B. P., Boewono, D. T. Colonization of Anopheles maculatus from Central Java, Indonesia. J Am Mosq Control Assoc. 18, 359-363 (2002).
- Beier, M. S., Beier, J. C., Merdan, A. A., el Sawaf, B. M., Kadder, M. A. Laboratory rearing techniques and adult life table parameters for Anopheles sergentii from Egypt. J Am Mosq Control Assoc. 266, 266-270 (1987).
- Benedict, M. Q. Care and maintenance of anopheline mosquitoes, The molecular biology of disease vectors: A methods manual. Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. , Champman & Hall. London. 3-12 (1997).
- Casanges, A. H., Mcgovran, E. R., Chiles, J. V. Rearing of Anopheles quadrimaculatus Say and Aedes aegypti (L.) in the laboratory. Mosq News. 9, 112-117 (1949).
- Merritt, R. W., Dadd, R. H., Walker, E. D. Feeding behavior, natural food and nutritional relation ships of larval mosquitoes. Annual Rev. Entomol. 37, 349-376 (1992).
- Nasirian, H., Ladonni, H. Artificial bloodfeeding of Anopheles stephensi on a membrane apparatus with human whole blood. J Am Mosq Control Assoc. 22, 54-56 (2006).
- Ng'habi, K. R., John, B., Nkwengulila, G., Knols, B. G., Killeen, G. F., Ferguson, H. M. Effect of larval crowding on mating competitiveness of Anopheles gambiae mosquitoes. Malar J. 30 (4), 49 (2005).
- Stobart, R. H. Factors affecting the control of body volume in the larvae of the mosquitoes Aedes aegypti and Aedes detritus. Edw. J. Exp. Boil. 54, 67-82 (1971).
