Summary
Questo video illustra le tecniche generali utilizzate per posteriore Anopheles gambiae in laboratorio. I metodi per la cura per le zanzare di laboratorio sono dimostrati in tutte le fasi del ciclo di vita dell'organismo da larve di pupe al sangue al seno adulti.
Abstract
Questo protocollo descrive l'allevamento di zanzare nel insectary. Le camere insectary sono mantenuti a 28 ° C e umidità ~ 80%, con un hr 12. ciclo giorno / notte. Per questa procedura, avrete bisogno di gabbie zanzara, 10% di soluzione di saccarosio sterile, asciugamani di carta, bicchiere, carta da filtro Whatman, alimentatori vetro, sangue e siero umano, bagnomaria, parafilm, acqua distillata, vassoi di plastica pulita, cibo zanzara (descritto sotto), al netto di coprire i vassoi, vuoto, e una camera di raccolta per raccogliere gli adulti di zanzara.
Protocol
Mosquito cibo:
- Un cibo: cibo per pesci a terra (Aquaricare). Una piccola presa deve essere aggiunto.
- Cibo B: messa a terra degli alimenti CAT (Purina). Una piccola presa deve essere aggiunto.
- Cibo C: cibo per gatti (Purina). Due compresse deve essere aggiunto.
Sangue:
Sangue umano o animale può essere usato per le zanzare posteriore. Sangue fresco viene raccolto con una siringa e messo in una provetta sterile 15 ml Falcon contenenti 1ml di CPD (anticoagulante) per ogni 10 ml di sangue, poi mescolate gentilmente e centrifugati a temperatura ambiente a 2000 rpm per 5 min. Il supernatante viene scartato, avendo cura di togliere il cappotto buffy che comprende le cellule del sangue (ad esempio WBC). Il pellet RBC viene poi sospeso in un volume equivalente di mezzo RPMI pipettando, e ulteriormente lavati in questo mezzo tre volte. Dopo l'ultimo lavaggio, i globuli rossi sono pellet risospeso in un volume equivalente di mezzo RPMI e conservato a 4 ° C (può essere mantenuto per 8-10 giorni). Poco prima l'alimentazione, l'RBC (in RPMI) viene centrifugato (2000 rpm per 5 min) per far sedimentare le cellule, e la RBC confezionato è risospeso nel siero (O + siero umano) per ottenere un ematocrito al 40%. Il sangue deve essere mantenuta a 37 ° C sempre per l'alimentazione.
GIORNO 1:
- Il 3-5 zanzare adulte giorno di vita femminili sono nutriti del sangue per deporre le uova.
- Per l'alimentazione del sangue, una membrana artificiale (parafilm) metodo di alimentazione è utilizzato come segue:
- I globuli rossi (vedi sopra per la preparazione del sangue) sono mescolati con siero inattivato con il calore per ottenere un ematocrito ~ 40% (imballato RBC 40% e siero 60%). Questa è aggiunto l'alimentatore di vetro.
- L'alimentatore è collegato ad un acqua calda-giacca (37 ° C), e posto sulla gabbia per consentire l'accesso zanzare alla superficie della membrana.
- Le zanzare sono autorizzati a mangimi per ~ 30 minuti.
3 ° GIORNO:
- Le femmine depongono le uova due giorni dopo si nutrono di sangue. Un piccolo filtro di carta avvolta in una forma conica viene messo in un piccolo becher contenente acqua distillata, facendo in modo che la carta da filtro diventa umida. Il bicchiere è conservata all'interno della gabbia durante la notte per le zanzare di deporre le uova.
GIORNO 4:
- La carta da filtro contenente le uova di zanzara è posto in una vaschetta di plastica con circa 300 ml di acqua distillata. Un pizzico di cibo A è aggiunto il vassoio e le uova sono autorizzati a schiudersi per le larve durante i prossimi giorni.
GIORNI 5 - 8:
- Larve in crescita sono alimentati tutti i giorni con due compresse di cibo C, e monitorati per la densità e la popolazione. L'ottavo giorno (5 giorni le larve di età), la popolazione larve è diluito da 1 vassoio per ~ 10 vassoi, con un pizzico di cibo A e due compresse di C cibo in ogni vassoio. (~ 30 minuti)
GIORNI 9-12:
- Le larve sono nutriti ogni giorno con il cibo C. Il giorno 12 (9 larve giorno di vita), l'acqua viene cambiata con acqua dolce, e il cibo è aggiunto (un pizzico di cibo B e due compresse di cibo C). La pupa inizia a sviluppare in questa fase. I vassoi sono coperti con reti per evitare fuoriuscita di adulti. (~ 8-10 minuti)
GIORNO 13 - 15:
Le pupe sono autorizzati ad emergere agli adulti per i prossimi 2 - 3 giorni. Il cibo è somministrato ogni giorno alle larve / pupe con attenzione la rimozione della rete per evitare la fuoriuscita degli adulti.
GIORNO 16:
- Gli adulti sono raccolte in una gabbia con un aspiratore collegato al vuoto. La gabbia è costituito da un piccolo flacone da 100 ml con uno stoppino di cotone che è impregnato con il 10% di saccarosio (autoclave) e un rivestimento tovagliolo di carta sul fondo per mettere a mollo le fuoriuscite di zucchero potenziali che possono verificarsi durante la manipolazione gabbia. (~ Min 30-40)
Giorno 17 - 21:
- Gli adulti (maschi e femmine) vengono poi mantenuti nella stanza insectary per 4-5 giorni, nutriti con saccarosio 10% prima di essere di nuovo sangue alimentato per iniziare il ciclo successivo. Le zanzare stesso può essere utilizzato per deporre le uova più di una volta.
- Le zanzare che non sono necessari per gli esperimenti o allevamento possono essere uccisi mettendo la gabbia in un congelatore. I vassoi utilizzati e le gabbie devono essere puliti e asciugati prima di poter essere utilizzato nuovamente.
Nota: Ci possono essere delle variazioni nel metodo di allevamento di zanzare e laboratori diversi possono avere diverse tecniche.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Food A | Aquaricare | Grounded fish food. A small pinch needs to be added. | ||
| Food B | Purina | Grounded cat food. A small pinch needs to be added. | ||
| Food C | Purina | Cat food. Two tablets needs to be added | ||
| RBC | prepared red blood cells: 40% hematocrit in human serum | |||
| RPMI | Medium | |||
| CPD | anticoagulant | |||
| serum | O+ human serum | |||
| Mosquito feeder | ||||
| parafilm | ||||
| Anopheles gambiae | mosquitos | |||
| 10% sucrose | mosquito food | |||
| insectary |
References
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