Summary
Vi kommer att visa installationen och analys av pre-mikroRNA 96-bra arrayer för QPCR med hjälp av en robot och för hand med en Thermo Scientific Matrix multikanalpipett.
Abstract
Kvantitativa realtids-PCR (QPCR) har framträtt som en korrekt och värdefullt verktyg i profileringen nivåer genuttryck. En av dess många fördelar är en lägre detektionsgräns jämfört med andra metoder för profilering av genuttryck när du använder mindre mängder av input för varje analys. Automatiserad qPCR inställning har förbättrats detta område genom att medge mer reproducerbarhet. Det bekväma och snabb installation möjliggör hög genomströmning experiment, vilket gör att profilering av många olika gener samtidigt i varje försök. Denna metod tillsammans med invändig plåt kontroller minskar också experimentella variabler gemensamma för andra tekniker. Vi nyligen utvecklat en qPCR assay för profilering av pre-mikroRNA (pre-miRNA) med en uppsättning av 186 primerpar. MikroRNA har uppstått som en ny klass av små icke-kodande RNA med möjlighet att reglera många mRNA mål på efter transkriptionella nivå. Dessa små RNA är först transkriberas av RNA-polymeras II som en primär miRNA (pri-miRNA) avskrift, som sedan klyvs i föregångaren miRNA (pre-miRNA). Pre-miRNA exporteras till cytoplasman där Dicer klyver hårnål slingan för att ge mogna miRNA. Ökningar av miRNA nivåer kan ses på både föregångare och mogna nivåer miRNA och profilering av båda dessa former kan vara användbart. Det finns flera kommersiellt tillgängliga analysmetoder för mogna miRNA, men kan deras höga kostnader avskräcker forskare från denna profilering teknik. Här diskuterar vi en kostnadseffektiv, pålitlig, SYBR baserad qPCR metod för profilering pre-miRNA. Förändringar i pre-miRNA avspeglar ofta mogna miRNA förändringar och kan vara en värdefull indikator på mogna miRNA uttryck. Däremot kan samtidig profilering av både pre-miRNA och mogna miRNA vara optimal eftersom de kan bidra nonredundant information och ge insikt i mikroRNA bearbetning. Dessutom kan den teknik som beskrivs här att utökas till att omfatta profilering av andra bibliotek satser för specifika vägar eller patogener.
Protocol
Den qPCR före miRNA profilering arrayer kan sättas upp som helt automatiserad med en Tecan Freedom Evo robot (A) eller för hand med Matrix elektroniska multikanalpipett (B).
1) Förbered Master Mix, primer tallrikar och prover.
- Primer plattor innehåller 186 primerpar i 96-bra format (totalt 2 plattor) vid 12:05 bör förvaras vid -80 ° C. Tina plattorna i rumstemperatur, virvel och centrifugera kort före användning.
- För att förbereda Master Mix, tina upp SYBR Grön 2x PCR-Mix i rumstemperatur. Varje reaktion använder 8ul Master Mix med 2ul primer. Sammansättningen av Master Mix per reaktion är 4ul SYBR blandning 3ul PCR-kvalitet vatten och 10-20 ng prov-DNA eller cDNA.
- För installation av varje 96-bra primer plattan kommer fyra Master Mix rör behövas. Kan köras 4 prov per platta (singlicate), 2 prover per platta (dubbla) eller ett enstaka prov i fyra exemplar.
- Förbered Master Mix genom att kombinera SYBR, vatten och prov i varje 4-2 ml Eppendorf-rör. Varje rör bör innehålla tillräckligt Master Mix för cirka 100 reaktioner, vilket gör att överskottet för pipettering av avfall. Vortex att blanda.
A. Inställning av pre-miRNA analysen med Freedom Tecan Evo robot.
- Efter initiering av roboten och lastning av Evoware programmet, spola tre gånger med 30mls var att rensa systemet med luftbubblor som kommer att störa pipettering noggrannhet.
- Setup roboten plattform för att bland annat följande:
- Märkt 384-brunnars platta
- 96-bra primer platta (1)
- Huvudmixar
- Ett tråg innehållande 2% blekmedel
- En fylld systemet vätskebehållare
- Töm avfallsbehållare
- Börja roboten körs genom att välja "Kör" två gånger.
- I slutet av programmet, ta bort 384-brunnar och tillslut LightCycler 480 tätning folie och centrifugera en kort stund. Placera förseglade 384-brunnar i position 1 av hotellet.
- Gå till steg 2,2 och upprepa för primer tallrik 2 med nya huvudmixar och en ny 384-brunnar.
- Placera förseglade plattan i position 2 på hotellet.
- Öppna nya Evoware program för Loading LightCycler från hotellet och välj "Kör" två gånger.
- Frihet Evo kommer automatiskt att ladda varje platta i LightCycler och kör följande SYBR-gröna I / HRM cykling program:
Pre (1 cykel):
50 ° i 5 minuter i ramp hastighet av 4,8 ° / sek
95 ° i 5 minuter i ramp hastighet av 4,8 ° / sek
Amp (45 cykler):
95 ° i 15 sek vid rampen hastighet av 4,8 ° / sek
62 ° i 30 sek vid ramp med 2,5 ° / sek
(Single datainsamling under detta steg)
Smältning kurva:
95 ° i 5 sek vid rampen hastighet av 4,8 ° / sek
60 ° i 1 minut vid ramp med 2,5 ° / sek
95 ° kontinuerlig i ramp hastighet av 0,11 ° / sek
med 5 förvärv per ° C
Cool:
50 ° i 30 sek vid rampen hastighet av 25 ° / sek
- Frihet Evo kommer automatiskt att ladda varje platta i LightCycler och kör följande SYBR-gröna I / HRM cykling program:
B. Inställning av pre-miRNA analysen med Matrix elektroniska multikanalpipett:
- Placera innehållet i Master Mix rör 1 i en reservoar.
- Ställ in den elektroniska pipetten för att aspirera 16ul av Master Mix med 2-8ul dispensera steg följdes av en utrensning steg.
- För Master Mix 1, fördela 8ul till alla andra brunn på 384-brunnar (inställd på 384-brunnars spets avstånd), som börjar med väl A1. (Dvs brunnar A1, C1, E1, etc.) För andra 8ul undvara, flytta till kolumn 3 (dvs. brunnar A3, C3, E3, etc.) sedan rensa bort över en papperskorg och avyttra tips.
- Följer detta mönster för resterande 5 cykler tills du når väl A23.
- Upprepa för Master Mix 2, (början med väl A2, C2, E2, etc.), Master Mix 3 (med början vid väl B1, D1, F1, etc.), Master Mix 4 (som börjar vid B2, D2, F2, etc. .).
- För aliquotting av primer tallrik, ställ elektronisk pipett att aspirera 2ul och avstå 2ul med en utrensning steg efter. Tillsätt 2ul av primers från kolumn 1 i 96-bra primer platta (AH) i 384-brunnar, brunnar A1, C1, E1, etc. Purge över en papperskorg och avyttra tips. Upprepa för brunnar A2, C2, E2, B1, D1, F1, och B2, D2, F2, osv
- Upprepa för rader 2-12 av 96-bra primer, flytta över alla 2 kolumner för varje primer kolumn, till dess att full 384-brunnar har aliquotted.
- Seal plattor med en LightCycler tätning folie och centrifugera en kort stund.
- Placera plattorna i en LightCycler 480 och cykla plattorna enligt följande inställningar med hjälp av SYBR Green I / HRM upptäckt format:
Pre (1 cykel):
50 ° i 5 minuter i ramp hastighet av 4,8 ° / sek
95 ° i 5 minuter i ramp hastighet av 4,8 ° / sek
Amp (45 cykler):
95 ° i 15 sek vid rampen taktpå 4,8 ° / sek
62 ° i 30 sek vid ramp med 2,5 ° / sek
(Single datainsamling under detta steg)
Smältning kurva:
95 ° i 5 sek vid rampen hastighet av 4,8 ° / sek
60 ° i 1 minut vid ramp med 2,5 ° / sek
95 ° kontinuerlig i ramp hastighet av 0,11 ° / sek
med 5 förvärv per ° C
Cool:
50 ° i 30 sek vid rampen hastighet av 25 ° / sek - Upprepa med primer plåt 2, aliquotting i en ny 384-brunnar med nygjord huvudmixar.
Hemligheter till framgång:
En viktig egenskap när man utformar PCR-matriser är att alla 186 primerpar har samma glödgning temperatur, så att plattan kan köras på samma optimala PCR inställningar köra programmet.
Varje ny array bör kontrolleras med tre kontroller före kör prover. Dessa kontroller är:
1 kör av alla grundfärger springa med vatten eller 0,1 x TE att utesluta primer kontamination.
1 kör av omväxlande vatten / TE och en positiv kontroll för att säkerställa ingen överföring.
3 kör med samma positiva kontrollen, för att säkerställa reproducerbarhet mellan körningarna.
Mästare blandar bör beredas och tallrikar ska köras inom 24 timmar för optimalt resultat
Primer plattan folie bör tas bort långsamt för att minska risken för smitta mellan brunnar.
När du använder en robot med fast tips, är 2% blekmedel tvätt som behövs för att tvätta tips mellan varje pipettering steg, följt av en vattenspolning. Detta förhindrar och eliminerar överföring, som annars kan förorena uppgifter och leda till entydiga resultat.
Efter en tallrik drivs igenom LightCycler, ska den inte öppnas igen i PCR inställning rummet. Detta förebygger PCR kontamination.
Representativa resultat:
qPCR resultat är i typiska fall av CT-värden som bestäms från LightCycler analysprogram. En lyckad körning består vanligtvis av en rad av CTS för prover, vanligtvis mellan 20-35 för prover som är positiva. De vattenprover i en bra kör alltid på en CT på> 40 och eventuella prover eller specifika brunnarna med en CT över 37 betraktas som negativa eller inte upptäcks. Som en allmän regel, prover ger en CT av <10 är också opålitliga och är utestängda från vidare analys. Det finns flera sätt att analysera qPCR data och införandet av den interna kontrollen i vår analys hjälper till att kontrollera för variation av provet ingång. Före miR array innehåller en U6 kontroll primer, som ofta används som referens genen att normalisera CT-värden från olika prover. Detta normaliserat värde kallas deltat CT-värde (DCT). Resultaten är ofta diagram som råa CT, DCT värde eller kan analyseras ytterligare till standardiserade värden.
I Figur 1, analys av hela före mikroRNA samling av fyra olika prover från en tidsförloppet experiment presenteras i heat map-format. Den relativa uttryck för varje förskola mikroRNA visas och tre stora, distinkta kluster vuxit fram. Majoriteten av analyserade före miRs genomgick små, obetydliga förändringar som förväntat (Figur 1A). Var dock en liten del av pre-mikroRNA minskat avsevärt (Figur 1B) eller ökat dramatiskt (figur 1C) i hela tidsförloppet experimentet. Halterna av uttryck för varje förskola mikroRNA normaliserades till 0h tidpunkterna (prov 1) som en baslinje nivå. I vissa fall kan du notera att några av de klustrade före mikroRNA också kluster tillsammans i heatmap analys (ex: låt-7a, Figur 1B). Beroende på försöket kan kluster uppstår som är beroende av virusinfektion, celltyp specifika uttryck för pre-mikroRNA eller pre-miRs som regleras av en gemensam molekyl eller signalväg.
Före mikroRNA-analysen som vi har utvecklat innehåller också ett antal kända virus före mikroRNA och gener kodas av Kaposis sarkom associerat herpesvirus (KSHV) och Epstein Barr virus (EBV) utöver det mänskliga före miRs. Dessa kan användas som positiva eller negativa kontroller, beroende på cellinje och virus som används har status prover. I Figur 2, är den genomsnittliga CT från en KSHV-negativt prov körs i fyra exemplar visas. Viktigt var KSHV LANA inte upptäckas på detta prov av mycket känsliga qPCR array. Men U6 - vår interna kontroll och låt-7a - var en mycket uttryckt människa före mikroRNA, uttryckt i mätbara halter. Slutligen, som väntat, gjorde den negativa kontrollen av PCR-grade vatten ger inte en qPCR produkt.
En annan indikator på en framgångsrik qPCR springa är ett bra smälter kurva analys, som kan ge inblick i eventuella föroreningar i proverna. Att etablera en smälttemperatur, är plåten värms upp långsamt efter PCR är klar. Eftersom DNA-strängar separat, är SYBR grön släpps, och fluorescenssignalen minskar. Den temperatur vid vilken denna Drop sker är grafiskt, och är känd som smälttemperatur provet. Beroende på DNA-sekvensen, prover smälter vid olika temperaturer från varandra och från vattnet negativ kontroll, som inte borde ha en smälttemperatur eftersom inget DNA finns. PCR-produkterna från varje primer paret ska smälta på liknande temperaturer. Till exempel visar figur 3 en analys smältande kurva för två olika primers använda samma prov i två exemplar. Det är klart att smälttemperaturen är olika för de två primerpar men provet smälter vid exakt samma temperatur för varje replikat. Tecken på en dålig eller potentiellt förorenade prov kan omfatta flera smälter toppar, vilket tyder på förekomsten av två olika källor till input.
Figur 1. Pre-mikroRNA signaturer uppstår genom profilering enligt en ny qPCR-baserad matris. Den genomsnittliga deltaCTU6 beräknades och standardiserade värden lastades in i ArrayMinerTM mjukvara, vilket ger tre olika kluster visas som heatmaps. (A) före mikroRNA med små förändringar i uttrycket visas. Pre-mikroRNA vars nivåer var signifikant minskat (B) eller ökad (C) visas också. Blått motsvarar lägre nivåer av uttryck medan rött representerar ökat uttryck nivåer.
Figur 2. Införande av intern kontroll i qPCR-baserade före mikroRNA array. Den råa CT-värden för tre olika gener och en ingen mall kontroll visas. U6 används som en intern positiv kontroll medan PCR H2O fungerar som vår negativa kontroll. Låt-7a-1-1 är ett mikroRNA uttrycks normalt i många olika celltyper, medan KSHV LANA kan användas antingen som en positiv eller negativ kontroll, baserat på virusets status cellinje eller används vävnad.
Figur 3. Smältning topp analys av pre-mikroRNA primers och brist på provkontaminering. Smältande kurvor erhölls med TM ringer analysen i LightCycler programvaran. Två olika grundfärger (primer A och B) för samma prov kördes i duplikat visas. Smälttemperaturen för varje primer är tydlig. Har dock prov bara en topp, visar avsaknaden av provkontaminering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
QPCR är en mycket känslig analysmetod som kan användas för att jämföra nivåer genuttryck mellan proverna i en studie, samt att bestämma positivitet i händelse av virus. Fördelen med att använda qPCR matriser är möjligheten att köra många primers (i vårt fall, 186 primerpar) för varje prov i en kort tid. Med hjälp av en pipett robot som Tecan Frihet Evo, den tid som krävs för att ställa ett experiment upp kan minskas ytterligare, och noggrannheten och konsekvensen i roboten kan minska och eliminera pipettering fel. Här kan vi visa hur man använder en Tecan Frihet Evo att inrätta ett mikroRNA array, samt en alternativ metod att använda en matris Elektronisk multikanalpipett, som kan genomföras av laboratorier som inte har tillgång till en pipettering robot. qPCR arrayer är också fördelaktigt eftersom alla gener kan normaliseras till en enda uppsättning av referens gener köras på samma tallrik, minska kostnaderna och antalet reaktioner.
Som nämnts finns det flera viktiga funktioner som är nödvändiga när man utformar en sådan matris. Eftersom alla prover på PCR-plattan kommer att bedrivas på samma villkor, är det viktigt att utforma primers som fungerar på samma temperaturer och inställningar, eller några par grundfärg kommer att misslyckas. Vid utformningen av primer bör sekvenser alltid kontrolleras av BLAST sökning för att säkerställa att det finns homologi till din genen av intresse och inga andra gener.
När du kör arrayen är det viktigt att miljön är sterilt och fritt från PCR föroreningar som kan leda till falska positiva. Om möjligt bör PCR inrättas i ett sterilt arbete huva eller en separat rent rum, där PCR-produkter aldrig används. Bänkar bör tvättas med Eliminase, vatten och etanol, och utsätts för UV-ljus i minst en timme efter körningen är klar.
Fördelen med denna teknik är att samma strategi som gäller för en uppsättning av gener ska profileras genom att helt enkelt byta ut miRNA arrayen med en matris med en annan uppsättning primer par. Vårt labb innehåller för närvarande arrayer för pre-miRNA, KSHV, EBV, p53, och NFkB - som alla kan köras i en identisk metod för dem som visas. Flexibiliteten i detta test gör att våra lab att utföra hög kapacitet genen profilering snabbt och tillförlitligt för alla primerpar som vi vill skärmen.
Här beskrev vi arrayen med hjälp av cDNA från mänskliga cellinjer till uttryck profil miRNA nivåer vid aktivering under en period. Förutom att karakterisera cellinjer kan arrayen också användas för att analysera kliniska prover. Efter RNA isolering kan cDNA syntes ske, och cDNA kan köras med denna samling för att karakterisera genuttryck. Detta kan vara användbart för att bestämma virus positivitet, eller gen profiler uttryck för att ytterligare karakterisera vilka gener som uppregleras i prover från infekterade patienter. Sammanfattningsvis automatiserade qPCR-baserade arrayer är reproducerbara och tillförlitliga analyser som möjliggör mycket känslig detektion av en mängd olika gener från vävnader och cellinjer i tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH bidrag DE018304, R01DE018281. KT stöds av T32 GM07092-34 och genom ett stipendium till University of North Carolina i Chapel Hill från Howard Hughes Medical Institute (HHMI) genom Med i Grad Initiative. PC stöds av T32 CA009156.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freedom Evo 150 | Tecan Group Ltd. | 30017587 | |
| Matrix Electronic Multichannel Pipette | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2001-MTX | (or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above) |
| Matrix Integrity Filter Tips, Sterile | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 7435 | (or comparable tip for multichannel used) |
| Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master | Roche Group | 04 707 516 001 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Group | 05015243001 | 384-well version |
| Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche Group | 04729749001 | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche Group | 04729757001 | |
| LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software | Roche Group | 05075122001 | |
| Eliminase Decontaminant | Decon Laboratories | 04-355-31 |
References
- Bustin, A. A. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Frégeau, C. J. Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention. J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).
- O'hara, A. J. Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma. PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).
