Summary
وتعتزم هذه المقالة لوصف بطريقة متدرجة واستخداما
Abstract
خلايا شوان هي واحدة من الخلايا تستخدم عادة في استراتيجيات إصلاح التالية اصابات النخاع الشوكي. خلايا شوان هي قادرة على دعم التجديد ومحواري تنتشر عن طريق إفراز عوامل النمو وتوفير النمو 1،2 تعزيز التصاق الجزيئات والجزيئات 3 4 المصفوفة خارج الخلية. بالإضافة إلى أنها myelinate المحاوير عديمة الميلين في موقع الإصابة 5.
لكن بعد الزرع ، وخلايا شوان لا تهاجر من موقع والزرع لا تتداخل مع المضيف 6،7 النجمية. هذه النتائج في تشكيل حدود حادة بين خلايا شوان والخلايا النجمية ، وخلق عقبة أمام تزايد المحاوير تحاول الخروج من الكسب غير المشروع مرة أخرى في النسيج المضيف قريب وبشكل أقصى. النجمية على اتصال مع خلايا شوان يخضع أيضا تضخم وتصل تنظيم الجزيئات المثبطة 8-13.
في فحوصات المختبر استخدمت لنموذج التفاعلات خلية نجمية شوان وكانت مهمة في فهم الآلية الكامنة وراء السلوك الخلوية.
هذه المقايسات في المختبر وتشمل فحص الحدود ، حيث يتم إجراء التعاون ثقافة باستخدام اثنين من خلايا مختلفة مع كل نوع من الخلايا الأراضي المحتلة مختلفة مع فجوة صغيرة فقط تفصل بين الجبهات الخلية اثنين. كما انقسام الخلايا ، وترحيل ، والجبهتين الخلوية الاقتراب من بعضها البعض ، وتصطدم في نهاية المطاف. هذا يسمح للسلوك المجموعتين السكانيتين الخلوية ليتم تحليلها على الحدود. اختلاف آخر من نفس الأسلوب هو مزيج المجموعتين السكانيتين الخلوية في الثقافة وبمرور الوقت أنواع الخلايا two عزل خلايا شوان مع تجمعت معا كما في الجزر بين النجمية خلق معا متعددة شفان نجمية الحدود.
في مقايسة الثانية المستعملة في دراسة التفاعل بين أنواع الخلايا اثنين هو مقايسة الهجرة حيث يمكن تتبع حركة الخلوية على السطح من نوع من الخلايا الأخرى المونولاير 14،15. ومن المعروف عموما هذا الاختبار كما مقايسة ساترة مقلوب. يتم استزراع خلايا شوان على شظايا زجاجية صغيرة والمقلوب التي يواجهونها باستمرار على سطح monolayers نجمية ويتم تقييم الهجرة من على حافة ساترة.
وقد تم كل من المقايسات مفيدة في دراسة الآليات الكامنة وراء المشاركة في استبعاد الخلوية وتشكيل الحدود. حددت بعض الجزيئات باستخدام هذه التقنيات تشمل Cadherins N - 15 ، شوندرويتين البروتيوغليكان كبريتات (CSPGs) 16،17 ، جمعية جيل المستقبل / الهيبارين 18 ، أفسس / Ephrins 19.
وتعتزم هذه المقالة لوصف مقايسة الحدود والهجرة في مقايسة أزياء متدرج وإلقاء الضوء على المشاكل التقنية الممكنة التي قد تحدث.
Protocol
1. حدود الفحص :
- وتعد الشرائح المغلفة الدائرة مع بولي - D - يسين الشرائح الزجاجية بين عشية وضحاها ومعقمة قبل بدء التجربة : إعداد الأساسية. مستعدة المتوسطة التي تستخدم في التعديل متوسطة Dulbecco النسر (DMEM) ، على أن تستكمل مع 10 ٪ مصل العجل الجنين (FCS) ، و 1 ٪ البنسلين ، الستربتوميسين - Fungizon (PSF). كما يتم تحضير زجاجة من الكالسيوم / المغنيسيوم حل هانكس مجانا الملح المتوازن (HBSS).
- وtrypsinized الأولية الفئران خلايا شوان المستزرعة في قارورة لمدة 3 دقائق باستخدام التربسين 0.1 ٪. هو trypsinized الأولية ثقافة نجمية الفئران لمدة 5 دقائق باستخدام التربسين 0.1 ٪.
هو inactived التربسين بإضافة DMEM تستكمل مع FCS 10 ٪ و 1 ٪ PSF. - يتم نقل Trypsinized خلايا شوان والخلايا النجمية لفصل 15 مل أنابيب الصقر وطرد في 300G لمدة 5 دقائق.
- هي خلايا شوان والخلايا النجمية إعادة علقت في كثافة 2 × 10 6 (انظر القسم لممثل نتائج التغيرات في كثافة الخلية).
- يتم وضع قطرة 50 ميكرولتر من تعليق خلية شوان في نهاية واحدة من الآبار المغلفة PDL الشريحة الغرفة. وقد استخدم الشريط الزجاج لتشويه الانخفاض نحو وسط الغرفة لإنشاء حافة مستقيمة. (استخدام قطع الزجاج ، وقطع الزجاج coverslips مستطيلة طوليا بحيث أنه يلائم عرض الشرائح المستخدمة في غرفة المقايسات الحدود)
- وضعت قطرة والثاني من 50 ميكرولتر من تعليق نجمية في الطرف الآخر من نفس البئر وطخت نحو الوسط لخلق حافة مستقيمة موازية للتشهير مع أول قطرة صغيرة 0.2mm فجوة بينهما.
- الغرفة التي تحتوي على شرائح توضع قطرات في الحاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- بعد 2 ساعة ، وكانت تغسل مع الثقافات DMEM لإزالة غير المرفقة الحطام الخلوية والمتوسطة الطازجة التي تحتوي على DMEM / 10 ٪ FCS / 1 ٪ PSF المضافة.
ملاحظة : DMEM / 10 ٪ FCS / 1 ٪ يمكن أن تستكمل قوات الأمن الفلسطينية مع forskolin (2μM) واستخراج الغدة النخامية البقري (BPE) (10μg / مل) تحفز تكاثر الخلايا شوان. وسوف تزود BPE عوامل النمو اللازمة للسماح طويلة المدى خلية شوان الثقافة وforskolin يثير مستويات الأدينوزين الحلقي الأدينوساين داخل خلايا شوان للحث على الانتشار - يتم استزراع خلايا لحوالي 8-10 أيام عند 37 درجة مئوية ، و 7 ٪ CO 2 الحاضنة. المتوسط يتطلب تغيير كل 3 أيام. سوف الجبهات الخلية two تصل في النهاية بعضها البعض ، وحدود حادة ستشكل بين أنواع الخلايا اثنين. ويمكن في هذه المرحلة يتم تحليل التجارب من العوامل التي تدخل في تشكيل الحدود.
- يمكن ان تكون ثابتة شارك في ثقافة استخدام الفورمالدهايد 4 ٪ ويمكن immunostained خلايا شوان مع P75 المضادة للأجسام المضادة والخلايا النجمية مع أجسام مضادة للGFAP لتحديد الخلايا في الثقافة المشتركة. P75 الضد تعترف منخفضة تقارب NGF مستقبلات على خلايا شوان التي تفتقر الخلايا النجمية. الأضداد المضادة للGFAP تعترف الدبقية firbrillary البروتين الحمضية التي يموضع إلى السيتوبلازم نجمية. (يرجى الرجوع إلى الشكل 1A ممثل عن الحدود)
2. الهجرة الفحص :
- 4 لوحات جيدا (15mm الآبار) والمغلفة PDL بين عشية وضحاها ، وأعد لخلق monolayers نجمية.
- الثقافة هي trypsinized نجمية الابتدائية لمدة 5 دقائق باستخدام التربسين 0.1 ٪. هو المعطل التربسين بإضافة DMEM تستكمل مع FCS 10 ٪ و 1 ٪ PSF وطرد في الخلية 300G لمدة 5 دقائق. (انظر الشكل 2)
- والنجمية إعادة علقت في الخلايا 1x10 5 / مليلتر. يضاف 1 مل من هذا الحل لكل PDL مغلفة جيدا في 4 لوحات جيدا. يتم استزراع الخلايا النجمية ل24-48 ساعة حتى أحادي الطبقة غير متلاقية تماما.
- لتقييم شوان الهجرة خلية على monolayers نجمية ، بالتوازي مع خلق monolayers نجمية ، يتم وضع الزجاج الدائرية coverslips PDL المغلفة في أنبوب 50 مل وسحقت باستخدام ماصة بلاستيكية لإنشاء أجزاء صغيرة من الزجاج.
- يتم نقل شظايا الزجاج في بئر في 6 طبق طبق بشكل جيد ومناسب باستخدام الملقط شظايا يتم اختيار الحجم وتوضع في آبار أخرى. توضع شظايا الزجاج 5 في كل بئر في 6 لوحات جيدا.
- وtrypsinized الأولية خلايا شوان المستزرعة في قارورة لمدة 3 دقائق باستخدام التربسين 0.1 ٪. يتم نقل Trypsinized خلايا شوان لفصل 15 مل أنبوب الصقر وطرد في 300 G لمدة 5 دقائق. هي خلايا شوان إعادة علقت في 2X 10 6 خلية / مل في DMEM/10 ٪ PSF FCS / 1 ٪.
- يضاف 20 قطرات ميكرولتر من خلايا شوان تعليق على كل أجزاء ساترة 5 6 لوحات وضعت في الخلايا بشكل جيد ويتم تحضين في 37 ° C CO ، 7 2 ٪ لمدة 2 ساعة.
- بعد 2 ساعة ، هي التي تعلق على خلايا شوان إلى شظايا ساترة وDMEM/10 ٪ FCS / 1 ٪ PSF (تستكمل مع 2μM من forskolin و10μg / مل من BPE يضاف إلى كل بئر بحيث يتم تغطيتها بالكامل مع شظايا متوسطة) .
- ثم توضع على لوحات تحتوي على 6 جيدا شظايا في حاضنة لل24-48 ساعة حتى شظايا الزجاج ويخدع بالكاملبطلاقة مع خلايا شوان.
- مرة واحدة هي شظايا متموجة مع خلايا شوان ، واختار كل قطعة بعناية حتى باستخدام الملقط حادة وتراجع في HBSS لإزالة الخلايا غير مرتبط ثم وجه مقلوب أسفل إلى المونولاير نجمية.
- ثم يتم تغطية كل جيدا مع 1 مل من DMEM/10 ٪ مسموح FCS / 1 ٪ PSF وخلايا شوان لترحيل للفترة 24-48. ويمكن خلال هذه الفترة التجريبية يمكن إضافة الكواشف مثل عوامل النمو لتقييم تأثيرها على عدد وبعد الهجرة من خلايا شوان.
- بعد فترة والهجرة ، ويتم إصلاح شظايا الزجاج في الجزء السفلي من كل بئر وذلك بإضافة بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) لمدة 30 دقيقة. التثبيت التالية ، immunostain خلايا شوان لP75 (الاعتراف انخفاض مستقبلات تقارب NGF) ثم وصمة عار لهم باستخدام ABC strepavidin محفظة diaminobenzidine (DAB) ، للسماح التصور للخلايا شوان تحت المجهر الخفيفة.
3. ممثل النتائج :
بعد 8-10 أيام شفان نجمية المشترك الثقافات تظهر حدود حادة بين أنواع الخلايا اثنين. هذه الحدود هي أكثر وضوحا إذا تم استخدام forskolin وBPE في الثقافة وشوان تكاثر الخلايا ويتعزز.
إذا لوحظ أي الحدود خلال الفترة من يوم 10 ، ويمكن زيادة الوقت للثقافة أخرى حتى يتم تأسيس حدود. تغيير نسبة كثافة الخلية هو وسيلة بديلة لزيادة تكوين الحدود. ويمكن استخدام الخلايا نجمية الكثافة عند إعداد تعليق الخلية 8،18 : نسبة شفان 3:1.
immunostaining التالية للتعرف على خلايا شوان والخلايا النجمية ، لتقييم اختلاط الخلية يمكن رسم خط حيث تم تأسيس الحدود ويمكن عدها عدد خلايا شوان يهاجرون إلى الأراضي نجمية تحت المجهر مضان.
وأدناه مثالين من الصور التي تم الحصول عليها حدود ، واحدة مع الفصل بشكل جيد من خلايا شوان والخلايا النجمية الشكل (1A) واحد حيث لم يفصل الخلايا بشكل جيد في المناطق المختلفة بسبب أسلوب الفقراء (الشكل 1B).
مقايسة الحدود الرقم 1 : شفان نجمية التفاعل. أ) لمدة 10 أيام شارك في ثقافة الفحص في حضور وforskolin BPE شوان لتحفيز تكاثر الخلايا يوضح حدود حادة بين أنواع الخلايا اثنين (الحمراء = P75 ، أخضر = GFAP). ب) يوم 10 شارك في الثقافة مقايسة حيث لم يتم تشكيل الحدود والجبهات two الخلية المختلطة. كان هذا بسبب اختلاط قطرات اثنين في حين وضع قطرات خلية نجمية وشوان بجوار بعضها البعض أثناء إعداد الحدود (الحمراء = P75 ، أخضر = GFAP).
الشكل 2. صورة ممثل المونولاير نجمية متكدسة
المقايسات تقييم حركة الهجرة من نوع خلية واحدة على سطح الخلية ونوع آخر تقييم بالتالي ظاهرة مختلفة عن تلك التي تشكل الحدود.
وهناك حاجة لضمان الممارسة على عكس coverslips على monolayers لا يؤدي إلى الأضرار التي لحقت خلية شوان المغطاة شظايا الزجاج وmonolayers نجمية بواسطة الملقط حادة. ويمكن لتقييم الهجرة من خلايا شوان ، والمسافة القصوى للهجرة وعدد من الخلايا المهاجرة من على حافة ساترة تقاس تحت المجهر الخفيفة.
وأدناه صورة خلايا شوان ملطخة P75 باستخدام الأجسام المضادة تلطيخ DAB على سطح المونولاير نجمية (الشكل 3).
فحص الهجرة الرقم 3. مقلوب باستخدام مقايسة ساترة. أ) خلايا شوان (البني ، immunostained مع P75 الضد) المهاجرة بعيدا عن حافة ساترة. يشير السهم إلى اتجاه الهجرة بعيدا عن الخلية ساترة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
استخدمت المقايسات المبينة أعلاه في الدراسات المختلفة مما يدل على دور عوامل متعددة تشارك في تشكيل الحدود بين شفان النجمية ومحدودية الهجرة خلية شوان في بيئة نجمي.
فهم الآليات الكامنة وراء هذه الأحداث هو ضروري لأنه يسمح بوضع استراتيجيات لتحسين وتعزيز التكامل بين الطعوم زرع خلايا شوان التالية ، وبذلك تسهل الخروج من المحاور تجديد من الخلف الكسب غير المشروع في النسيج المضيف السماح بتشكيل اتصالات مع الأنسجة المضيف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر فيليبا ارن للحصول على مساعدة عينية لها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41966-029 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170-088 | |
| FCS | Invitrogen | 10091-148 | |
| PSF | Invitrogen | 15240-062 | |
| BPE | Invitrogen | 13028-014 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344273 | |
| Coverlips | VWR international | 631-0149 | |
| Coverlips(rectangle) | Menzel-Glaser | BB022050A1 | |
| Chamber slides | Nalge Nunc international | 177380 | |
| 4 well plates, 6 well plates | Nalge Nunc international | 4 well plates6 well plates | |
| rat p75 antibody | EMD Millipore | MAB365 | |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | |
| Secondary antibodies (Alexa-conjugated) | Invitrogen | A-11004 A-11034 | Goat anti mouse 568Goat anti Rabbit 488 |
| Secondary biotinylated | Vector Laboratories | Goat anti mouse | |
| DAB tablets | Sigma-Aldrich | D4418 | |
| ABC elite kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6168 | |
| Fluorosave | Calbiochem | 345789 |
References
- Assouline, J. G. Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors. Brain Res. 428, 103-118 (1987).
- Taylor, J. S., Bampton, E. T. Factors secreted by Schwann cells stimulate the regeneration of neonatal retinal ganglion cells. J Anat. 204, 25-31 (2004).
- Reichardt, L. F. Integrins and cell adhesion molecules: neuronal receptors that regulate axon growth on extracellular matrices and cell surfaces. Dev Neurosci. 11, 332-347 (1989).
- Chiu, A. Y., Monteros,, Espinosa de los, A., Cole, R. A., Loera, S., de Vellis, J. Laminin and s-laminin are produced and released by astrocytes, Schwann cells, and schwannomas in culture. Glia. 4, 11-24 (1991).
- Blakemore, W. F. Remyelination of CNS axons by Schwann cells transplanted from the sciatic nerve. Nature. 266, 68-69 (1977).
- Andrews, M. R., Stelzner, D. J. Evaluation of olfactory ensheathing and schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord. J Neurotrauma. 24, 1773-1792 (2007).
- Iwashita, Y., Fawcett, J. W., Crang, A. J., Franklin, R. J., Blakemore, W. F. Schwann cells transplanted into normal and X-irradiated adult white matter do not migrate extensively and show poor long-term survival. Exp Neurol. 164, 292-302 (2000).
- Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
- Lakatos, A., Barnett, S. C., Franklin, R. J. Olfactory ensheathing cells induce less host astrocyte response and chondroitin sulphate proteoglycan expression than Schwann cells following transplantation into adult CNS white matter. Exp Neurol. 184, 237-246 (2003).
- Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. Astrocyte-Schwann cell interactions in culture. Glia. 11, 367-377 (1994).
- Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. Chondroitin sulfate proteoglycan staining in astrocyte-Schwann cell co-cultures. Glia. 14, 145-152 (1995).
- Plant, G. W., Bates, M. L., Bunge, M. B. Inhibitory proteoglycan immunoreactivity is higher at the caudal than the rostral Schwann cell graft-transected spinal cord interface. Mol Cell Neurosci. 17, 471-487 (2001).
- Fishman, P. S., Nilaver, G., Kelly, J. P. Astrogliosis limits the integration of peripheral nerve grafts into the spinal cord. Brain Res. 277, 175-180 (1983).
- Fok-Seang, J., Mathews, G. A., ffrench-Constant, C., Trotter, J., Fawcett, J. W. Migration of oligodendrocyte precursors on astrocytes and meningeal cells. Dev Biol. 171, 1-15 (1995).
- Wilby, M. J. N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes. Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).
- Grimpe, B. The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces. Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).
- Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced. Glia. , (2010).
- Santos-Silva, A. FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis. J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).
- Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling. J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).
