Summary
यह आलेख stepwise फैशन में वर्णन करना चाहता है आमतौर पर इस्तेमाल किया
Protocol
1. सीमा परख:
- मूल तैयारी: चैंबर स्लाइड पाली - डी Lysine रातोंरात और बाँझ गिलास स्लाइड के साथ लेपित हैं प्रयोग शुरू करने से पहले तैयार कर रहे हैं. मध्यम Dulbecco संशोधित ईगल (DMEM) मध्यम, 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) के साथ पूरक है, और 1% पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन Fungizon (पीएसएफ) का उपयोग करने के लिए तैयार है. / कैल्शियम मैगनीशियम मुक्त हैंक्स संतुलित नमक समाधान (HBSS) की एक बोतल भी तैयार है.
- प्राथमिक चूहे श्वान फ्लास्क में संवर्धित कोशिकाओं के तीन मिनट के लिए 0.1% trypsin का उपयोग trypsinized हैं. प्राथमिक चूहे astrocyte संस्कृति 5 मिनट के लिए 0.1% trypsin का उपयोग trypsinized है.
Trypsin द्वारा inactived DMEM जोड़ने 10% FCS और 1% पीएसएफ के साथ पूरक है. - Trypsinized श्वान कोशिकाओं और astrocytes 15 एमएल बाज़ ट्यूबों अलग स्थानांतरित कर रहे हैं और 5 मिनट के लिए 300g पर centrifuged.
- श्वान कोशिकाओं और astrocytes 2 10 x 6 के घनत्व पर फिर से निलंबित कर दिया (सेल घनत्व में बदलाव के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें) .
- श्वान सेल निलंबन के 50 μL ड्रॉप PDL लेपित चैम्बर स्लाइड कुओं के एक छोर पर रखा गया है. एक गिलास पट्टी कक्ष के केंद्र की ओर ड्रॉप स्मियर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था एक सीधे बढ़त उत्पन्न. (एक ग्लास कटर का प्रयोग, एक आयताकार गिलास coverslips longitudinally इतनी कटौती कर रहे हैं कि यह स्लाइड कक्ष की चौड़ाई सीमा assays के लिए इस्तेमाल किया फिट होगा)
- Astrocyte निलंबन का 50 μL के एक दूसरे ड्रॉप एक ही अच्छी तरह से विपरीत अंत में रखा गया था और केंद्र की ओर लिप्त एक सीधे उन दोनों के बीच एक छोटे 0.2mm अंतराल के साथ पहली बूंद स्मियर करने के लिए समानांतर बढ़त बनाने.
- चैम्बर युक्त बूँदें 37 में इनक्यूबेटर में रखा जाता है ° 2 घंटे के लिए सी स्लाइड.
- 2 घंटे के बाद, संस्कृतियों DMEM से धोया गया गैर संलग्न सेलुलर मलबे और ताजा DMEM / 10% FCS / 1% पीएसएफ जोड़ी युक्त मध्यम हटाने.
नोट: / 10 DMEM% FCS 1 /% पीएसएफ के साथ पूरक (2μM) forskolin और गोजातीय पीयूषिका (BPE) निकालने (10μg / एमएल) श्वान सेल प्रसार को प्रोत्साहित किया जा सकता है है. BPE दीर्घकालिक श्वान सेल संस्कृति की अनुमति आवश्यक वृद्धि कारकों की आपूर्ति और श्वान कोशिकाओं के भीतर forskolin चक्रीय adenosine monophosphate स्तर को उठाती प्रसार को प्रेरित - कक्ष लगभग 37 डिग्री सेल्सियस, 7% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 8-10 दिनों के लिए सुसंस्कृत हैं. मध्यम के लिए हर 3 दिनों बदला जा आवश्यकता है. दो सेल मोर्चों अंततः एक दूसरे तक पहुँचने के लिए और एक तेज सीमा दो प्रकार की कोशिकाओं के बीच फार्म का होगा. इस स्तर पर प्रयोग किया जा सकता है सीमा के गठन में शामिल कारकों का विश्लेषण.
- सह संस्कृति 4% formaldehyde और श्वान कोशिकाओं विरोधी p75 एंटीबॉडी और विरोधी GFAP एंटीबॉडी के साथ astrocytes सह संस्कृति में कोशिकाओं की पहचान के साथ immunostained किया जा सकता है है का उपयोग कर तय किया जा सकता है. P75 एंटीबॉडी श्वान कोशिकाओं जो astrocytes कमी पर कम आत्मीयता NGF रिसेप्टर को पहचानता है. एंटी - GFAP एंटीबॉडी glial firbrillary अम्लीय प्रोटीन जो astrocyte cytoplasm localizes पहचानता है. (कृपया प्रतिनिधि सीमा के लिए चित्रा 1A देख)
2. प्रवासन परख:
- 4 अच्छी तरह प्लेटें (15mm कुओं) PDL लेपित रातोंरात और astrocyte monolayers बनाने के लिए तैयार है.
- प्राथमिक astrocyte संस्कृति के 5 मिनट के लिए 0.1% trypsin का उपयोग trypsinized है. Trypsin जोड़ने DMEM 10% FCS और पीएसएफ 1% और 5 मिनट के लिए 300g पर centrifuged सेल के साथ पूरक द्वारा निष्क्रिय है. (चित्रा 2 देखें)
- Astrocytes 1x10 5 कोशिकाओं / एमएल पर फिर से निलंबित कर दिया. इस समाधान के 1 एमएल 4 अच्छी तरह से प्लेटों में प्रत्येक PDL अच्छी तरह से लेपित करने के लिए जोड़ा जाता है. Astrocytes 24-48 घंटे के लिए संवर्धित कर रहे हैं जब तक monolayer पूरी तरह से मिला हुआ है.
- Astrocyte monolayers पर श्वान सेल प्रवास आकलन, astrocyte monolayers, परिपत्र PDL लेपित गिलास coverslips 50 एमएल ट्यूब में रखा जाता है और एक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करने के लिए कांच के छोटे टुकड़ों बनाने कुचल समानांतर बनाने के लिए.
- ग्लास टुकड़े एक अच्छी तरह से में 6 अच्छी तरह से थाली थाली में स्थानांतरित कर रहे हैं और आकार के टुकड़े उपयुक्त संदंश का उपयोग कर चुना और अन्य कुओं में रखा. 5 गिलास टुकड़े प्रत्येक कुएं में 6 अच्छी तरह से प्लेट में रखा जाता है.
- प्राथमिक श्वान फ्लास्क में संवर्धित कोशिकाओं के तीन मिनट के लिए 0.1% trypsin का उपयोग trypsinized हैं. Trypsinized श्वान कोशिकाओं के लिए 15 एमएल बाज़ ट्यूब को अलग करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं और 5 मिनट के लिए 300 जी में centrifuged. श्वान कोशिकाओं 2x पर DMEM/10% / 1 FCS% पीएसएफ में 10 6 कोशिकाओं / एमएल फिर से निलंबित कर दिया.
- श्वान कोशिकाओं निलंबन के 20 μL बूंदों प्रत्येक 5 coverslip 6 अच्छी तरह प्लेटें और कोशिकाओं में रखा टुकड़े कर रहे हैं 37 ° सी 7,% 2 घंटे के लिए सीओ 2 में incubated पर जोड़ा जाता है.
- 2 घंटे के बाद, श्वान कोशिकाओं coverslip टुकड़े संलग्न हैं और एफसीएस DMEM/10% /% 1 पीएसएफ (forskolin और 10μg / BPE के एमएल 2μM के साथ पूरक एक अच्छी तरह जोड़ा है ताकि टुकड़े पूरी तरह से मध्यम के साथ कवर कर रहे हैं) .
- 6 अच्छी तरह से टुकड़े युक्त प्लेटें तो 24-48 घंटे के लिए कर रहे हैं इनक्यूबेटर में रखा जब तक कांच टुकड़े पूरी तरह से चोर हैंश्वान कोशिकाओं के साथ धाराप्रवाह.
- एक बार टुकड़े श्वान कोशिकाओं के साथ मिला हुआ हैं, प्रत्येक टुकड़ा उठाया है ध्यान से तेज संदंश का उपयोग और HBSS में डूबा हुआ है स्वाधीन कोशिकाओं को हटाने और फिर astrocyte monolayer पर औंधा चेहरा नीचे.
- हर अच्छी तरह से तो DMEM/10% 1 / FCS% पीएसएफ और श्वान कोशिकाओं के लिए 24 से 48 की अवधि के लिए विस्थापित करने के लिए अनुमति दी जाती है 1 एमएल के साथ कवर किया जाता है. इस अवधि के दौरान वृद्धि कारकों जैसे प्रयोगात्मक अभिकर्मकों और श्वान कोशिकाओं के प्रवास की संख्या दूरी पर उनके प्रभाव का आकलन करने के लिए जोड़ा जा सकता है.
- प्रवास की अवधि के बाद, कांच के टुकड़े 30 मिनट के लिए 4% (पीएफए) paraformaldehyde जोड़कर प्रत्येक अच्छी तरह के नीचे करने के लिए तय कर रहे हैं. निम्नलिखित निर्धारण, p75 श्वान कोशिकाओं के लिए (कम आत्मीयता NGF रिसेप्टर को पहचानने) तो उन्हें दाग एबीसी किट diaminobenzidine strepavidin (थपका) का उपयोग कर, प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत श्वान कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति immunostain.
3. प्रतिनिधि परिणाम:
8-10 दिनों के बाद श्वान - astrocyte सह संस्कृतियों दो प्रकार की कोशिकाओं के बीच एक तेज सीमा दिखा. यह और अधिक स्पष्ट सीमा है अगर forskolin और BPE संस्कृति में प्रयोग किया जाता है के रूप में श्वान सेल प्रसार बढ़ाया है.
यदि कोई सीमा 10 दिन की अवधि के दौरान मनाया जाता है, संस्कृति का समय आगे बढ़ा जा सकता है जब तक सीमाओं स्थापित कर रहे हैं. सेल घनत्व के अनुपात बदलने से सीमा गठन में वृद्धि के लिए एक वैकल्पिक तरीका है. 03:01 श्वान का एक अनुपात: astrocyte सेल घनत्व जब सेल 8,18 निलंबन की तैयारी में इस्तेमाल किया जा सकता है.
Immunostaining बाद श्वान कोशिकाओं और astrocytes की पहचान करने के लिए खुलेपन एक लाइन जहां सीमा की स्थापना की है खींचा जा सकता है और श्वान astrocyte क्षेत्र में पलायन कोशिकाओं की संख्या प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे गिना जा सकता है है सेल का आकलन.
नीचे छवियों के दो उदाहरण प्राप्त सीमाओं, एक श्वान कोशिकाओं और astrocytes (चित्रा 1 क) और जहां कोशिकाओं को अच्छी तरह से गरीब तकनीक (चित्रा 1 बी) की वजह से विभिन्न प्रदेशों में अलग - अलग नहीं है अच्छी तरह से बनाई अलगाव के साथ कर रहे हैं.
श्वान - astrocyte बातचीत: चित्रा सीमा 1 परख. श्वान सेल प्रसार को प्रोत्साहित forskolin और BPE की उपस्थिति में) एक 10 दिन सह संस्कृति परख दो प्रकार की कोशिकाओं (= लाल p75, हरे = GFAP) के बीच एक तेज सीमा को दर्शाता है. बी) एक 10 दिन सह संस्कृति परख जहां सीमा नहीं बनाई है और दो सेल मोर्चों मिलाया. यह दो बूंदों का मिश्रण के कारण था जबकि astrocyte और श्वान सेल बूंदों सीमा की तैयारी के दौरान एक दूसरे के बगल में (= लाल p75, हरे = GFAP) रखने.
चित्रा 2 मिला हुआ astrocyte monolayer के प्रतिनिधि छवि.
प्रवासन assays किसी अन्य कोशिका प्रकार की सतह पर एक कोशिका प्रकार के आंदोलन का आकलन और इसलिए कि सीमा के गठन के से एक अलग घटना का आकलन.
अभ्यास monolayers पर inverting coverslips सुनिश्चित करने की जरूरत है सेल तेज संदंश द्वारा कवर कांच के टुकड़े और astrocyte monolayers. श्वान को नुकसान के लिए नेतृत्व नहीं करता है प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत श्वान कोशिकाओं, प्रवास के अधिकतम दूरी और coverslip के किनारे से पलायन कोशिकाओं की संख्या के प्रवास का आकलन करने के लिए मापा जा सकता है.
नीचे श्वान कोशिकाओं p75 astrocyte monolayer की सतह (चित्रा 3) पर थपका धुंधला का उपयोग एंटीबॉडी के साथ दाग की छवि है.
चित्रा प्रवासन 3. उल्टे coverslip परख का उपयोग परख. ए) श्वान कोशिकाओं (भूरे रंग के, p75 एंटीबॉडी के साथ immunostained) coverslip के किनारे से दूर पलायन. Coverslip से दूर सेल प्रवास की दिशा में तीर इंगित करता है.
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Discussion
ऊपर वर्णित assays विभिन्न श्वान astrocytes और astrocytic वातावरण में सीमित श्वान सेल प्रवास के बीच सीमा के गठन में शामिल कई कारकों की भूमिका का प्रदर्शन अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है.
इन घटनाओं अंतर्निहित तंत्र को समझना आवश्यक है के रूप में यह रणनीतियों के विकास का अनुकूलन करने के लिए अनुमति देते हैं और श्वान सेल grafts के प्रत्यारोपण के बाद एकीकरण बढ़ाने होगा और ऐसा करने में भ्रष्टाचार वापस से regenerating axons की मेजबान की अनुमति ऊतक में बाहर निकलने की सुविधा कनेक्शन के गठन मेजबान ऊतक के साथ.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम उसे तरह की मदद के लिए फिलिप वॉरेन धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41966-029 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170-088 | |
| FCS | Invitrogen | 10091-148 | |
| PSF | Invitrogen | 15240-062 | |
| BPE | Invitrogen | 13028-014 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344273 | |
| Coverlips | VWR international | 631-0149 | |
| Coverlips(rectangle) | Menzel-Glaser | BB022050A1 | |
| Chamber slides | Nalge Nunc international | 177380 | |
| 4 well plates, 6 well plates | Nalge Nunc international | 4 well plates6 well plates | |
| rat p75 antibody | EMD Millipore | MAB365 | |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | |
| Secondary antibodies (Alexa-conjugated) | Invitrogen | A-11004 A-11034 | Goat anti mouse 568Goat anti Rabbit 488 |
| Secondary biotinylated | Vector Laboratories | Goat anti mouse | |
| DAB tablets | Sigma-Aldrich | D4418 | |
| ABC elite kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6168 | |
| Fluorosave | Calbiochem | 345789 |
References
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