Summary
В этой статье намерен описать поэтапно часто используемых
Abstract
Шванн клетки являются одним из наиболее часто используемых клетками в ремонт стратегии следующие повреждения спинного мозга. Шванн клетки способны поддерживать аксонального регенерации и прорастанию на 1,2 секретирующие фактор роста и оказания содействия росту молекул адгезии 3 и внеклеточной матрицы молекул 4. Кроме того, они myelinate демиелинизированные аксонов в месте повреждения 5.
Однако после трансплантации, Шванн клетки не мигрируют с места имплантата и не смешиваются с принимающей астроциты 6,7. Это приводит к образованию резкой границы между клетками Шванн и астроцитов, создавая препятствие для роста аксонов пытается выйти трансплантата обратно в ткани хозяина проксимально и дистально. Астроциты в контакт с клетками Шванн также подвергаются гипертрофии и постоянно регулировать тормозное молекул 8-13.
В пробирке тесты были использованы для моделирования Шванн клеточных взаимодействий и астроциты играют важную роль в понимании механизмов, лежащих в основе сотовой поведения.
Эти тесты в пробирке включают границы анализа, где со-культуры осуществляется с помощью двух различных клеток каждого типа клеток занимающих разные территории только с небольшой разрыв, отделяющий два фронта клетки. Как клетки делятся и мигрируют, два сотовых фронтах стать ближе друг к другу и, наконец, сталкиваются. Это позволяет поведение двух клеточных популяций, которые будут проанализированы на границе. Другой вариант того же метода является сочетание двух клеточных популяций в культуре и в течение долгого времени два типа клеток выделять с клетками Шванн слипаются вместе, как между островами в астроциты вместе создание нескольких Шванн-астроцитов границ.
Второй анализа используются при изучении взаимодействия двух типов клеток является миграция анализа, где сотовая движение можно проследить на поверхности другого типа клеток монослоя 14,15. Этот анализ обычно известен как перевернутая анализа покровное. Шванн клетки культивируют на мельчайшие осколки стекла, и они обращены лицевой стороной вниз на поверхности астроцитов монослоев и миграции оценивается от края покровного.
И анализы играют важную роль в изучении основных механизмов, участвующих в клеточном изоляции и границы образования. Некоторые из молекул определяется с помощью этих методов включают N-Кадгерины 15, хондроитин сульфат протеогликаны (CSPGs) 16,17, FGF / Гепарин 18, Еф / Ephrins 19.
В этой статье намерен описать анализа границ и миграции в анализе поэтапно и выяснить возможные технические проблемы, которые могут возникнуть.
Protocol
1. Граница Пробирной:
- Основные приготовления: Палата слайды покрыты поли-D-лизин в ночное время и стерильные стеклянные пластинки готовятся перед началом эксперимента. Средний которая подготовлена с применением среднего Дульбеко изменения Орла (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), а 1% Пенициллин-Стрептомицин-Fungizon (НПФ). Также бутылку Кальций / Магний свободной Хэнкс сбалансированный солевой раствор (HBSS) получают.
- Первичная крысы Шванн клетки культивировали в колбе трипсином в течение 3 минут с помощью 0,1% трипсина. Первичная культура астроциты крысы трипсином в течение 5 минут с помощью 0,1% трипсина.
Трипсин является inactived, добавив DMEM с добавлением 10% FCS и 1% PSF. - Трипсинизировали шванновских клеток и астроцитов передаются отдельные 15 мл сокола труб и центрифугировали при 300G в течение 5 минут.
- Шванн клетки и астроциты повторно приостановил при плотности 2 х 10 6 (см. репрезентативные результаты раздел для изменения плотности клеток).
- 50 мкл каплю суспензии клеток Шванн находится на одном конце PDL лунок слайд камеры. Стеклянную пластину был использован для мазка падение к центру камеры для получения прямой край. (Использование стеклорез, прямоугольные покровные стекла разрезаются продольно, так что она будет соответствовать ширине камеры слайдов используется для границы анализы)
- Вторая капля 50 мкл астроцитов подвески была помещена на противоположном конце того же хорошо и смазывают по направлению к центру, чтобы создать линейку параллельно первой мазка падение с небольшой толщиной 0,2 мм зазор между ними.
- Камера слайды содержащие капли помещают в инкубатор при 37 ° С в течение 2 часов.
- Через 2 часа, культуры промывают DMEM удалять не подключенных распада клеток и свежей среде, содержащей DMEM / 10% FCS / 1% PSF добавил.
Примечание: DMEM / 10% FCS / 1% PSF может быть дополнена форсколина (2 мкм) и говядине гипофизарный экстракт (BPE) (10 мкг / мл) стимулирует пролиферацию клеток Шванн. BPE будет поставлять факторов роста необходимо, чтобы позволить долгосрочное ячейки Шванн культуры и форсколина поднимает циклический аденозин монофосфат уровней в шванновских клеток индуцировать пролиферацию - Клетки культивировали в течение примерно 8-10 дней при температуре 37 ° C, 7% СО 2 инкубатора. Среда требует, чтобы менять каждые 3 дня. Два фронта клетка в конце концов достигнет друг с другом и резкую границу образуют между этими двумя типами клеток. На этом этапе эксперименты можно проводить анализ факторов, влияющих на формирование границы.
- Сотрудничество культуры могут быть исправлены с помощью 4% формальдегида и Шванн клетки могут быть immunostained с анти-P75 антител и астроциты с анти-GFAP антител для идентификации клеток в совместной культуре. P75 антитело распознает низких сродство рецепторов NGF на клетки астроциты Шванн которых не хватает. Анти-GFAP антитело распознает глиальных firbrillary кислой белок, который локализуется в цитоплазме астроцитов. (Пожалуйста, см. Рисунок 1A для представителя границе)
2. Миграция Пробирной:
- 4 луночных планшетах (15 мм скважины) PDL покрытием в ночное время и готовы к созданию астроцитов монослоев.
- Первичная астроцитов культура трипсином в течение 5 минут с помощью 0,1% трипсина. Трипсин является инактивированной, добавив DMEM с добавлением 10% FCS и 1% PSF и клеточной центрифугировали при 300G в течение 5 минут. (См. рисунок 2)
- Астроциты повторно прерывается в 1х10 5 клеток / мл. 1 мл этого раствора добавляют в каждую лунку, покрытую PDL в 4 и пластин. Астроциты культивируют в течение 24-48 часов, пока монослой полностью вырожденная.
- Для оценки Шванн миграции клеток монослоя на астроциты, параллельно создав астроцитов монослоев, круговая PDL покрытием покровные стекла помещают в 50 мл трубки и раздавил использованием пластиковой пипетки для создания небольших фрагментов стекла.
- Стекло фрагменты переданы в хорошо в 6 хорошо блюдо пластину и с помощью щипцов подходящий размер фрагментов выбраны и размещены в других скважинах. 5 осколки стекла помещают в каждую лунку в 6 и пластин.
- Первичные элементы Шванн культивировали в колбе трипсином в течение 3 минут с помощью 0,1% трипсина. Трипсинизировали шванновских клеток передаются отдельные 15 мл сокола трубки и центрифугировали при 300 G в течение 5 минут. Шванн клетки ресуспендировали на 2x 10 6 клеток / мл в DMEM/10% FCS / 1% PSF.
- 20 мкл капли суспензии Шванн клеток добавляли в течение каждых 5 покровное фрагменты помещены в 6 хорошо пластин и клетки инкубируют при температуре 37 ° C, 7% CO 2 в течение 2 часов.
- Через 2 часа, Шванн клетки прикрепляются к покровным фрагменты и DMEM/10% FCS / 1% PSF (с добавлением 2 мкм форсколина и 10 мкг / мл BPE добавляется в каждую лунку, так что фрагменты полностью покрыты среды) .
- 6 хорошо чашки, содержащие фрагменты затем помещаются в инкубатор на 24-48 часа, пока осколки стекла, полностью консвободно с клетками Шванн.
- Как только фрагменты сливающийся с клетками Шванн, каждый фрагмент подобран тщательно острыми щипцами и опускают в HBSS, чтобы удалить одинокие клетки, а затем перевернутой лицом вниз на астроциты монослоя.
- Каждая скважина затем покрывается 1 мл DMEM/10% FCS / 1% PSF и Шванн клетки могут мигрировать от 24 до 48 периода. В течение этого периода экспериментального реагентов, таких как факторы роста могут быть добавлены, чтобы оценить их влияние на количество и расстояния миграции клеток Шванн.
- После миграции период, осколки стекла крепятся к нижней части каждой лунки, добавляя 4% параформальдегида (PFA) в течение 30 минут. После фиксации, immunostain Шванн клеток для p75 (учитывая низкую аффинность рецепторов NGF), то окраска их с помощью АВС-Комплект strepavidin диаминобензидина (DAB), чтобы обеспечить визуализацию шванновских клеток под световым микроскопом.
3. Представитель Результаты:
После 8-10 дней Шванн-астроцитов совместно культур показывают резкую границу между этими двумя типами клеток. Эта граница является более выраженным, если форсколина и BPE используется в культуре как Шванн пролиферации клеток усиливается.
Если нет границы наблюдается в течение 10 дней, время культура может быть увеличен еще до границы устанавливаются. Изменение соотношения плотности клеток является альтернативным способом увеличения границы формации. Соотношении 3:1 Шванн: астроцитов плотность клеток могут быть использованы при подготовке клеточные суспензии 8,18.
После иммуноокрашивания определить Шванн клетки и астроциты, оценить ячейки смешение линии могут быть сделаны где граница устанавливается и количество клеток Шванн мигрирующие в астроциты территории можно пересчитать под флуоресцентным микроскопом.
Ниже приведены два примера изображений, полученных границы, одно хорошо сформировавшейся сегрегации шванновских клеток и астроцитов (рис. 1А) и тот, где клетки не отделены хорошо в различных территориях из-за плохой техники (рис. 1В).
. Рисунок 1 Граница анализа: Шванн-астроцитов взаимодействия. А) 10 день со-культура тест, в присутствии форсколина и BPE, чтобы стимулировать пролиферацию клеток Шванн демонстрирует резкую границу между этими двумя типами клеток (красный = P75, зеленый = GFAP). Б) 10 день со-культуры анализа, где границы не образуется и двух фронтах ячейки смешанные. Это было связано с перемешиванием две капли при размещении астроцитов и Шванн капель ячейки рядом друг с другом во время подготовки границы (красный = P75, зеленый = GFAP).
Рисунок 2. Представителю образ сливной астроцитов монослоя
Миграция тесты оценки движения одного типа клеток по поверхности другого типа клеток и, следовательно, оценивать различные явления от граничных образования.
Практика необходима для обеспечения обращения покровные на монослоев не приводит к повреждению Шванн ячейки покрытые осколками стекла и астроцитов монослоев резким щипцами. Для оценки миграции клеток Шванн, максимальное расстояние миграции и числа мигрирующих клеток от края покровного может быть измерена в световой микроскоп.
Ниже представлена картинка шванновских клеток окрашивали антителами P75 использования DAB пятен на поверхности астроцитов монослоя (рис. 3).
Рисунок 3. Миграция методом с использованием перевернутой анализа покровное. ) Шванн клеток (коричневый, immunostained с p75 антитела) мигрируют от края покровного. Стрелка указывает на направление миграции клеток от покровного стекла.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализы, описанные выше, были использованы в различных исследований, демонстрирующих роль несколько факторов, влияющих на формирование границы между Шванн-астроциты и ограниченной ячейке Шванн миграции в астроцитарных окружающей среды.
Понимание механизмов лежащих в основе этих событий имеет важное значение, поскольку это позволит разработка стратегий для оптимизации и повышения интеграции трансплантатов Шванн клетка после трансплантации и тем самым облегчить выход из аксонов регенерирующим трансплантата обратно в ткани хозяина позволяет образование связей с тканями организма.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Филиппа Уоррен для нее вид помощи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41966-029 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170-088 | |
| FCS | Invitrogen | 10091-148 | |
| PSF | Invitrogen | 15240-062 | |
| BPE | Invitrogen | 13028-014 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344273 | |
| Coverlips | VWR international | 631-0149 | |
| Coverlips(rectangle) | Menzel-Glaser | BB022050A1 | |
| Chamber slides | Nalge Nunc international | 177380 | |
| 4 well plates, 6 well plates | Nalge Nunc international | 4 well plates6 well plates | |
| rat p75 antibody | EMD Millipore | MAB365 | |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | |
| Secondary antibodies (Alexa-conjugated) | Invitrogen | A-11004 A-11034 | Goat anti mouse 568Goat anti Rabbit 488 |
| Secondary biotinylated | Vector Laboratories | Goat anti mouse | |
| DAB tablets | Sigma-Aldrich | D4418 | |
| ABC elite kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6168 | |
| Fluorosave | Calbiochem | 345789 |
References
- Assouline, J. G. Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors. Brain Res. 428, 103-118 (1987).
- Taylor, J. S., Bampton, E. T. Factors secreted by Schwann cells stimulate the regeneration of neonatal retinal ganglion cells. J Anat. 204, 25-31 (2004).
- Reichardt, L. F. Integrins and cell adhesion molecules: neuronal receptors that regulate axon growth on extracellular matrices and cell surfaces. Dev Neurosci. 11, 332-347 (1989).
- Chiu, A. Y., Monteros,, Espinosa de los, A., Cole, R. A., Loera, S., de Vellis, J. Laminin and s-laminin are produced and released by astrocytes, Schwann cells, and schwannomas in culture. Glia. 4, 11-24 (1991).
- Blakemore, W. F. Remyelination of CNS axons by Schwann cells transplanted from the sciatic nerve. Nature. 266, 68-69 (1977).
- Andrews, M. R., Stelzner, D. J. Evaluation of olfactory ensheathing and schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord. J Neurotrauma. 24, 1773-1792 (2007).
- Iwashita, Y., Fawcett, J. W., Crang, A. J., Franklin, R. J., Blakemore, W. F. Schwann cells transplanted into normal and X-irradiated adult white matter do not migrate extensively and show poor long-term survival. Exp Neurol. 164, 292-302 (2000).
- Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
- Lakatos, A., Barnett, S. C., Franklin, R. J. Olfactory ensheathing cells induce less host astrocyte response and chondroitin sulphate proteoglycan expression than Schwann cells following transplantation into adult CNS white matter. Exp Neurol. 184, 237-246 (2003).
- Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. Astrocyte-Schwann cell interactions in culture. Glia. 11, 367-377 (1994).
- Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. Chondroitin sulfate proteoglycan staining in astrocyte-Schwann cell co-cultures. Glia. 14, 145-152 (1995).
- Plant, G. W., Bates, M. L., Bunge, M. B. Inhibitory proteoglycan immunoreactivity is higher at the caudal than the rostral Schwann cell graft-transected spinal cord interface. Mol Cell Neurosci. 17, 471-487 (2001).
- Fishman, P. S., Nilaver, G., Kelly, J. P. Astrogliosis limits the integration of peripheral nerve grafts into the spinal cord. Brain Res. 277, 175-180 (1983).
- Fok-Seang, J., Mathews, G. A., ffrench-Constant, C., Trotter, J., Fawcett, J. W. Migration of oligodendrocyte precursors on astrocytes and meningeal cells. Dev Biol. 171, 1-15 (1995).
- Wilby, M. J. N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes. Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).
- Grimpe, B. The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces. Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).
- Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced. Glia. , (2010).
- Santos-Silva, A. FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis. J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).
- Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling. J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).
