Summary
本文拟在逐步时尚来形容常用的
Abstract
雪旺氏细胞修复策略常用的脊髓损伤后的细胞之一。雪旺氏细胞能够支持轴突再生和分泌生长因子1,2的发芽和提供增长，促进粘附分子和细胞外基质分子4。此外，他们还myelinate脱髓鞘轴突损伤5现场。
但移植后，雪旺氏细胞不从植入部位迁移，不混杂与主机的星形胶质细胞6,7。这样的结果形成的雪旺氏细胞和星形胶质细胞之间的尖锐边界，试图退出到宿主组织移植回近端和远端轴突增长的一个障碍。星形胶质细胞与雪旺氏细胞接触也经历肥大，上调8-13抑制分子。
在体外实验中已被用于模型雪旺氏细胞，星形胶质细胞相互作用，并已在了解细胞行为的机制的重要。
在体外试验 ，其中包括边界检测，其中一个共同的文化占领只是一个很小的分离两种细胞方面的差距与不同地区的每一个细胞类型中使用两种不同的细胞。随着细胞分裂和迁移，两个细胞战线得到彼此更加接近并最终相撞。这使得边界分析的两个细胞群的行为。同样的技术的另一个变化是混合文化中的两个细胞群，并随着时间的推移，两种类型的细胞与雪旺氏细胞分隔成群一起共同创建多个雪旺星形胶质细胞的界限的星形胶质细胞之间的岛屿。
第二个实验研究两种类型的细胞的相互作用是可以对其他类型的细胞单层 14,15表面跟踪的细胞运动迁移实验。这个实验是俗称倒盖玻片检测。雪旺氏细胞培养小玻璃碎片和面倒立到星形胶质细胞单分子膜的表面和迁移是从盖玻片边缘的评估。
两种检测已在研究参与细胞的排斥和边界形成的基本机制。一些分子确定使用这些技术包括N -钙粘素，硫酸软骨素蛋白多糖（CSPGs）16,17，FGF /肝素18，弗/ Ephrins 19。
本文拟来形容边界检测，并在逐步时尚迁移实验和澄清可能出现的技术可能出现的问题。
Protocol
1。边界含量：
- 基本准备：玻片过夜，无菌的D -聚赖氨酸的载玻片涂在开始实验前准备。中等准备使用贝科改良Eagle培养基（DMEM），辅以10％小牛血清（FCS），和1％的青霉素，链霉素Fungizon（PSF）。另外，准备一瓶免费汉克斯钙/镁平衡盐溶液（HBSS）。
- 烧瓶中培养的原代大鼠雪旺细胞胰酶消化3分钟，用0.1％胰蛋白酶。 5分钟，用0.1％胰蛋白酶原代大鼠星形胶质细胞培养，胰酶消化。
胰蛋白酶是灭活加入DMEM培养液含10％FCS和1％，涤纶短纤补充。 - 胰酶消化的雪旺氏细胞和星形胶质细胞被转移到单独的15毫升猎鹰管300G离心5分钟。
- 雪旺氏细胞和星形胶质细胞重新悬浮在密度为2 × 10 6（见代表性的结果节细胞密度的变化） 。
- 雪旺氏细胞悬液50μL下降被放置在一端的PDL涂商会幻灯片井。对香港总商会的中心是一个狭长的玻璃条涂抹下降，生成一个直边。 （使用玻璃切割机，一个长方形的盖玻片削减纵向所以它适合用于边界检测室幻灯片的宽度）
- 一个星形胶质细胞悬液50μL的第二个下拉被放置在同一井的另一端，对中心创建一个直边平行到与他们之间0.2毫米的差距小的首次下降涂抹抹上。
- 玻片包含滴是放置在孵化器在37 ° 2小时彗星。
- 2小时后，培养用DMEM清洗，以消除非连接的细胞碎片和新鲜的培养基中含有的DMEM / 10％的FCS / 1％，涤纶短纤补充。
注：DMEM / 10％FCS / 1％，涤纶短纤，可与福斯高林（2μm的）和牛垂体提取物（BPE）（10μg/ mL）的刺激雪旺氏细胞的增殖补充。 BPE将提供必要让长期的雪旺氏细胞培养的生长因子和forskolin的提高雪旺氏细胞内的环磷酸腺苷水平，诱导扩散 - 约8-10天，在37℃，7％的CO 2培养箱培养细胞。介质要求改为每3天。两种细胞战线将最终达到相互两种类型的细胞之间会形成锋利的边界。在这一阶段的实验，就可以进行分析边界形成中所涉及的因素。
- 使用4％的甲醛和雪旺氏细胞，可与抗P75抗体和抗GFAP抗体的星形胶质细胞识别共培养的细胞免疫染色，共培养，可以是固定的。 P75抗体承认对雪旺细胞，星形胶质细胞缺乏神经生长因子低亲和力受体。抗GFAP抗体确认了神经胶质firbrillary酸性蛋白，星形胶质细胞的细胞质定位。 （请参阅为代表的边界图1A）
2。迁移实验：
- 4孔板（15毫米井）是牙周膜涂层隔夜和创建星形胶质细胞单层的准备。
- 原发性星形胶质细胞的文化是5分钟，用0.1％胰蛋白酶胰酶消化。胰蛋白酶灭活的DMEM与10％FCS和1％，涤纶短纤和300G离心5分钟的细胞补充。 （见图2）
- 星形胶质细胞重悬在1 × 10 5细胞/ ml。 1毫升这种解决方案将被添加到每个PDL涂在4孔板。星形胶质细胞是单层培养24-48小时，直到完全融合。
- 以评估对星形胶质细胞单层的雪旺氏细胞迁移，并行创建星形胶质细胞单层，PDL涂层的圆形盖玻片放置在50毫升管，并用塑料吸管创造小片段的玻璃粉碎。
- 玻璃碎片以及转入6孔板菜和使用合适大小的碎片钳，选择并放置在其它井。被放置在6孔板每孔5个玻璃碎片。
- 初级雪旺氏烧瓶中培养的细胞为3分钟，用0.1％胰蛋白酶胰酶消化。胰酶消化雪旺氏细胞转移到单独的猎鹰管15毫升和300 G离心5分钟。雪旺氏细胞重新悬浮在2X DMEM/10％的FCS / 1％，涤纶短纤10 6细胞/ ml。
- 雪旺氏细胞悬液20μL，液滴被添加超过每5盖玻片置于6孔板和细胞培养在37 ° C，7％的CO 2小时2片段。
- 2小时后，雪旺氏细胞盖玻片片段DMEM/10％/ 1％FCS的的涤纶短纤（forskolin的和10μg/毫升的BPE2μm的补充是，每孔加入，使碎片完全覆盖中等） 。
- 包含片段6孔板，然后放置在孵化器，为24-48小时，直到玻璃碎片完全CON雪旺氏细胞流利。
- 一旦片段与雪旺氏细胞融合，每一个片段是拿起小心使用尖锐镊子，蘸在HBSS中删除独立的星形胶质细胞单层细胞，然后面倒立下来。
- 每口井，再覆盖1毫升DMEM/10％的FCS / 1％，涤纶短纤和雪旺氏细胞被允许迁移为24至48期。在此期间，如生长因子的实验试剂可以添加雪旺氏细胞移植的数量和距离，以评估其效果。
- 过渡期后，玻璃碎片固定为30分钟，加入4％多聚甲醛（PFA），每口井的底部。录制后，免疫染色P75的雪旺氏细胞（认识到低亲和力NGF受体），然后染色采用ABC strepavidin试剂盒，二氨基联苯胺（DAB），允许在光学显微镜下的雪旺氏细胞的可视化。
3。代表性的成果：
经过8-10天雪旺的星形胶质细胞共培养两种类型的细胞之间的尖锐边界。此边界更为明显，如果forskolin的和BPE是在文化作为雪旺氏细胞的增殖增强。
如果没有边界，是在10天的期限观察，可以进一步提高文化的时间，直到边界建立。改变细胞密度的比例，是一种替代的方式来增加边界形成。准备细胞悬液8,18时，可以用一个3:1的雪旺的比例：星形胶质细胞密度。
下列免疫识别的雪旺细胞和星形胶质细胞，评估细胞混合在一起，可以得出一条线边界建立和雪旺氏细胞移植到星形胶质细胞领土的数量可在荧光显微镜下计数。
下面是两个例子获得的图像界限，形成良好的雪旺氏细胞和星形胶质细胞（图1A）和一个细胞没有分隔成不同地区由于恶劣的技术（图1B）隔离。
图1边界检测：雪旺星形胶质细胞相互作用。 A）为期10天共培养检测forskolin的和BPE的存在，刺激雪旺氏细胞的增殖，演示之间的两种类型的细胞（红色= P75，绿色= GFAP）的急剧边界。 b）为期10天的合作培养法，边界是没有形成两个细胞战线不一。这是由于两个液滴的混合，而准备在边界放置星形胶质细胞和雪旺氏细胞液滴彼此相邻（红色= P75，绿色= GFAP）的。
图2融合的星形胶质细胞单层的形象代表。
迁移分析评估其他类型的细胞表面的一种细胞类型的运动，因此，评估一个边界形成的不同的现象。
实践需要，以确保转化到单层盖玻片不会导致损害雪旺氏细胞覆盖的玻璃碎片和星形胶质细胞单层尖锐的镊子。为了评估雪旺细胞迁移的最大距离和盖玻片边缘细胞迁移的数量的迁移，可以在光学显微镜下测量。
下面是P75使用上的星形胶质细胞单层的表面（图3）DAB染色的抗体染色的雪旺氏细胞的形象。
图3。迁移实验采用倒盖玻片检测。一）雪旺氏细胞（褐色，与P75抗体免疫染色），迁移远离盖玻片的边缘。箭头指向远离盖玻片的细胞迁移的方向。
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Discussion
上文所述的检测已用于各种研究证明在边界之间的雪旺星形胶质细胞和星形胶质细胞的环境有限的雪旺细胞迁移的形成涉及多种因素的作用。
了解这些事件的内在机制是至关重要的，因为这将使发展战略，优化和提高移植后的雪旺氏细胞移植的一体化，并在这样做方便出口到主机，让组织移植回再生轴突形成连接与宿主组织。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们要感谢她的帮助菲莉帕沃伦。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41966-029 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170-088 | |
| FCS | Invitrogen | 10091-148 | |
| PSF | Invitrogen | 15240-062 | |
| BPE | Invitrogen | 13028-014 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344273 | |
| Coverlips | VWR international | 631-0149 | |
| Coverlips(rectangle) | Menzel-Glaser | BB022050A1 | |
| Chamber slides | Nalge Nunc international | 177380 | |
| 4 well plates, 6 well plates | Nalge Nunc international | 4 well plates6 well plates | |
| rat p75 antibody | EMD Millipore | MAB365 | |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | |
| Secondary antibodies (Alexa-conjugated) | Invitrogen | A-11004 A-11034 | Goat anti mouse 568Goat anti Rabbit 488 |
| Secondary biotinylated | Vector Laboratories | Goat anti mouse | |
| DAB tablets | Sigma-Aldrich | D4418 | |
| ABC elite kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6168 | |
| Fluorosave | Calbiochem | 345789 |
References
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