Summary
Este artigo pretende descrever de forma gradual o comumente usado
Abstract
Células de Schwann são um dos células normalmente usadas em estratégias de reparo após lesões na medula espinhal. Células de Schwann são capazes de apoiar a regeneração axonal e surgimento de secreção 1,2 fatores de crescimento e fornecer factores de crescimento e moléculas de adesão 3 moléculas de matriz extracelular 4. Além disso, eles mielinizar os axônios desmielinizados no local da lesão 5.
No entanto após o transplante, as células de Schwann não migram do local de implante e não se misturam com os astrócitos anfitrião 6,7. Isto resulta na formação de uma fronteira nítida entre as células de Schwann e astrócitos, criando um obstáculo para os axônios em crescimento tentando sair da volta do enxerto no tecido do hospedeiro proximal e distalmente. Astrócitos em contato com células de Schwann também sofrem hipertrofia e up-regular as moléculas inibidoras 8-13.
Ensaios in vitro têm sido usados para modelar Schwann células-astrócitos interações e têm sido importantes para a compreensão do mecanismo subjacente ao comportamento celular.
Estes ensaios in vitro incluem teste de fronteira, onde a co-cultura é feita através de duas células diferentes, com cada tipo de célula que ocupam diferentes territórios, com apenas uma pequena diferença que separa as duas frentes de células. Como as células se dividem e migrar, as duas frentes de celulares se aproximar uns dos outros e, finalmente colidem. Isso permite que o comportamento das duas populações celulares a serem analisados na fronteira. Outra variação da mesma técnica é misturar as duas populações celulares em cultura e ao longo do tempo os dois tipos de células com as células de Schwann segregar aglutinados como ilhas entre astrócitos juntos criando múltiplas Schwann-astrócito limites.
Segundo ensaio utilizado no estudo da interação de dois tipos de células é o ensaio de migração celular, onde o movimento pode ser acompanhado na superfície do tipo de célula outras monocamada 14,15. Este ensaio é comumente conhecido como teste de lamela invertido. Células de Schwann são cultivadas em pequenos fragmentos de vidro e eles são invertidos face para baixo sobre a superfície de monocamadas de astrócitos e migração é avaliada a partir da borda da lamínula.
Ambos os ensaios têm sido fundamentais para estudar os mecanismos subjacentes envolvidos na exclusão celular e formação de fronteira. Algumas das moléculas identificadas usando estas técnicas incluem N-caderinas, 15 de proteoglicanos sulfato de condroitina (CSPGs) 16,17, FGF / Heparina 18, Ef / Efrinas 19.
Este artigo pretende descrever ensaio limite e ensaio de migração de forma gradual e elucidar os possíveis problemas técnicos que possam ocorrer.
Protocol
1. Ensaio de fronteira:
- Preparação básica: slides Câmara são revestidas com poli-D-lisina lâminas de vidro durante a noite e estéreis são preparados antes de iniciar o experimento. Médio está preparado usando Médio Modified Dulbecco Águia (DMEM), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FCS), e 1% penicilina-estreptomicina Fungizon (PSF). Também uma garrafa de cálcio / magnésio livre solução salina equilibrada Hanks (HBSS) é preparado.
- Células de Schwann de rato primários cultivados em frasco são tripsinizados por 3 minutos utilizando Tripsina 0,1%. Cultura primária de astrócitos de ratos é tripsinizados por 5 minutos, utilizando tripsina 0,1%.
Tripsina é inativada pela adição de DMEM suplementado com 10% SFB e PSF 1%. - Células de Schwann e astrócitos tripsinizados são transferidos para tubos de 15 mL em separado falcon e centrifugado a 300G por 5 minutos.
- Células de Schwann e astrócitos são re-suspenso na densidade de 2 x 10 6 (ver secção representativa resultados para variações de densidade celular).
- 50 mL queda de Schwann suspensão de células é colocado em uma extremidade do PDL poços deslize revestido de câmara. A faixa de vidro foi usado para manchar a queda em direção ao centro da câmara para gerar uma borda em linha reta. (Usando um cortador de vidro, um lamínulas de vidro retangular são cortadas longitudinalmente de modo que caberia a largura da câmara de slides utilizado para ensaios de limite)
- A segunda queda de 50 mL de suspensão de astrócitos foi colocado no extremo oposto do mesmo poço e manchada em direção ao centro para criar uma borda em linha reta paralela ao esfregaço primeira queda com um pequeno intervalo 0,2 milímetros entre eles.
- A câmara de slides contendo as gotas são colocadas na estufa a 37 ° C por 2 horas.
- Após 2 horas, as culturas foram lavadas com DMEM para remover não-inscritos restos celulares e meio fresco contendo DMEM / 10% FCS / 1% de PSF acrescentou.
Nota: DMEM / 10% FCS / 1% de PSF podem ser complementados com forskolin (2μM) e extrato de hipófise bovina (BPE) (10μg / mL) estimulam a proliferação das células de Schwann. BPE vai fornecer os fatores de crescimento necessário para permitir cultura de células de Schwann e de longo prazo forskolin aumenta o monofosfato de adenosina cíclico níveis dentro das células de Schwann para induzir a proliferação - As células são cultivadas por cerca de 80-10 dias a 37 ° C, 7% incubadora de CO 2. O meio precisa ser trocada a cada 3 dias. As duas frentes de células acabará por alcançar um ao outro e uma fronteira nítida irá formar entre os dois tipos de células. Nesta fase os experimentos podem ser realizados análise dos fatores envolvidos na formação de fronteira.
- Co-cultura pode ser fixado com formol 4% e as células de Schwann podem ser imunocoloração com anticorpo anti-P75 e astrócitos com anti-GFAP anticorpos para identificar as células em co-cultura. P75 anticorpo reconhece receptor de baixa afinidade NGF em células de Schwann que astrócitos falta. Anti-GFAP anticorpo reconhece a proteína glial ácida firbrillary que localiza-se citoplasma de astrócitos. (Por favor, veja Figura 1A de fronteira representante)
2. Ensaio de migração:
- 4 pratos bem (15mm poços) são PDL revestido durante a noite e preparados para a criação de monocamadas de astrócitos.
- Cultura de astrócitos primário é tripsinizados por 5 minutos, utilizando tripsina 0,1%. Tripsina é inativada pela adição de DMEM suplementado com 10% SFB e PSF 1% e de células centrifugadas a 300G por 5 minutos. (Veja Figura 2)
- Astrócitos são re-suspenso em 1x10 5 células / mL. 1 mL desta solução é adicionada a cada revestido PDL bem em 4 pratos bem. Astrócitos são cultivadas por 24-48 horas até que a monocamada é completamente confluentes.
- Para avaliar a migração das células de Schwann em monocamadas de astrócitos, em paralelo com a criação de monocamadas de astrócitos, circular lamínulas PDL-revestido de vidro são colocados em um tubo de 50 mL e esmagado com uma pipeta de plástico para criar pequenos fragmentos de vidro.
- Fragmentos de vidro são transferidos para um poço em 6 prato prato bem e usando uma pinça adequada fragmentos de tamanho são escolhidos e colocados em outros poços. 5 fragmentos de vidro são colocados em cada poço em 6 pratos bem.
- Pilhas de Schwann cultivadas em frasco são tripsinizados por 3 minutos utilizando tripsina 0,1%. Células de Schwann tripsinizados são transferidos para separar 15 mL tubo falcon e centrifugado a 300 G durante 5 minutos. Células de Schwann são re-suspenso em 2x 10 6 células / mL em DMEM/10% PSF FCS / 1%.
- 20 gotas mL da suspensão de células de Schwann é adicionado em cada cinco fragmentos de lamela colocada em 6 placas bem e as células são incubadas a 37 ° CO C, 7% 2 por 2 horas.
- Após 2 horas, as células de Schwann são presos aos fragmentos lamela e DMEM/10% FCS / 1% de PSF (complementado com 2μM de forskolin e 10μg / mL da BPE é adicionado a cada poço, para que os fragmentos são completamente cobertos com o meio) .
- Os 6 pratos bem contendo os fragmentos são então colocados na incubadora por 24-48 horas até que os fragmentos de vidro são totalmente confluente com células de Schwann.
- Uma vez que os fragmentos são confluentes com células de Schwann, cada fragmento é pego com cuidado usando uma pinça afiada e mergulhadas em HBSS para remover as células solto e então veremos face invertida para baixo sobre a monocamada de astrócitos.
- Cada poço é então coberto com 1 mL de DMEM/10% de células FCS / 1% de PSF e Schwann têm permissão para migrar para o período 24-48. Durante este período experimental reagentes, tais como fatores de crescimento podem ser adicionados para avaliar seu efeito sobre o número ea distância de migração de células de Schwann.
- Após o período de migração, os fragmentos de vidro são fixos ao fundo de cada poço, adicionando paraformaldeído a 4% (PFA) por 30 minutos. Fixação seguintes, as células de Schwann immunostain para p75 (reconhecendo baixa afinidade do receptor NGF), em seguida, mancha-los usando ABC strepavidin kit-diaminobenzidina (DAB), para permitir a visualização das células de Schwann em microscópio de luz.
3. Resultados representativos:
Após 8-10 dias Schwann-astrócito co-culturas mostram uma fronteira nítida entre os dois tipos de células. Este limite é mais pronunciada se forskolin e BPE é utilizado na cultura como a proliferação das células de Schwann é reforçada.
Se nenhum limite é observado durante o período de 10 dias, o tempo da cultura pode ser aumentada até que os limites são estabelecidos. Mudando a relação entre a densidade celular é uma forma alternativa para aumentar a formação de fronteira. A proporção de 3:1 Schwann: densidade de células astrócitos podem ser usados na preparação de suspensões de células 8,18.
Seguintes imunocoloração para identificar as células de Schwann e astrócitos, células para avaliar mistura uma linha pode ser desenhada onde o limite é estabelecido eo número de células de Schwann migrando para o território astrócitos podem ser contados em microscópio de fluorescência.
Abaixo estão dois exemplos de imagens obtidas fronteiras, com uma bem formada a segregação de células de Schwann e astrócitos (Figura 1A) e aquele em que as células não têm segregado bem em diferentes territórios, devido à má técnica (Figura 1B).
Figura ensaio Limite 1:. Schwann-astrócito interação. A) A 10 dias do ensaio de co-cultura na presença de forskolin e BPE para estimular a proliferação das células de Schwann demonstra uma fronteira nítida entre os dois tipos de células (vermelho = P75, verde = GFAP). B) Um dia 10 ensaio de co-cultura em que a fronteira não está formado e as duas frentes de células mistas. Isso ocorreu devido à mistura das duas gotas ao colocar gotas de células de Schwann e astrócitos ao lado do outro durante a preparação do limite (vermelho = P75, verde = GFAP).
Figura 2. Imagem representativa de monocamada confluente astrócitos
Ensaios de migração avaliar o movimento de um tipo de célula sobre a superfície de outro tipo de célula e, portanto, avaliar um fenômeno diferente da formação de fronteira.
Prática é necessária para garantir invertendo as lamelas em monocamadas não levar a danos à célula de Schwann cobertas de fragmentos de vidro e monocamadas de astrócitos pelo fórceps afiada. Para avaliar a migração de células de Schwann, a distância máxima da migração e do número de células migram a partir da borda da lamínula pode ser medido em microscópio de luz.
Veja abaixo a imagem de células de Schwann corados com anticorpo P75 usando coloração DAB na superfície da monocamada de astrócitos (Figura 3).
Figura ensaio de migração 3. Lamela usando ensaio invertido. A) As células de Schwann (marrom, imunocoloração com anticorpo p75), que migram para longe da borda da lamínula. Seta aponta para a direção da migração de células de distância da lamínula.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os ensaios descritos acima têm sido utilizados em vários estudos demonstrando o papel dos múltiplos fatores envolvidos na formação da fronteira entre o Schwann-astrócitos e migração de células de Schwann limitada em ambiente astrocíticos.
Compreensão dos mecanismos subjacentes a estes eventos é essencial, uma vez que permitiria o desenvolvimento de estratégias para otimizar e melhorar a integração de enxertos de células de Schwann após o transplante e com isso facilitar a saída dos axônios em regeneração da parte de trás do enxerto no tecido do hospedeiro permitindo a formação de conexões com o tecido hospedeiro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Filipa Warren por sua ajuda espécie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41966-029 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170-088 | |
| FCS | Invitrogen | 10091-148 | |
| PSF | Invitrogen | 15240-062 | |
| BPE | Invitrogen | 13028-014 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344273 | |
| Coverlips | VWR international | 631-0149 | |
| Coverlips(rectangle) | Menzel-Glaser | BB022050A1 | |
| Chamber slides | Nalge Nunc international | 177380 | |
| 4 well plates, 6 well plates | Nalge Nunc international | 4 well plates6 well plates | |
| rat p75 antibody | EMD Millipore | MAB365 | |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | |
| Secondary antibodies (Alexa-conjugated) | Invitrogen | A-11004 A-11034 | Goat anti mouse 568Goat anti Rabbit 488 |
| Secondary biotinylated | Vector Laboratories | Goat anti mouse | |
| DAB tablets | Sigma-Aldrich | D4418 | |
| ABC elite kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6168 | |
| Fluorosave | Calbiochem | 345789 |
References
- Assouline, J. G. Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors. Brain Res. 428, 103-118 (1987).
- Taylor, J. S., Bampton, E. T. Factors secreted by Schwann cells stimulate the regeneration of neonatal retinal ganglion cells. J Anat. 204, 25-31 (2004).
- Reichardt, L. F. Integrins and cell adhesion molecules: neuronal receptors that regulate axon growth on extracellular matrices and cell surfaces. Dev Neurosci. 11, 332-347 (1989).
- Chiu, A. Y., Monteros,, Espinosa de los, A., Cole, R. A., Loera, S., de Vellis, J. Laminin and s-laminin are produced and released by astrocytes, Schwann cells, and schwannomas in culture. Glia. 4, 11-24 (1991).
- Blakemore, W. F. Remyelination of CNS axons by Schwann cells transplanted from the sciatic nerve. Nature. 266, 68-69 (1977).
- Andrews, M. R., Stelzner, D. J. Evaluation of olfactory ensheathing and schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord. J Neurotrauma. 24, 1773-1792 (2007).
- Iwashita, Y., Fawcett, J. W., Crang, A. J., Franklin, R. J., Blakemore, W. F. Schwann cells transplanted into normal and X-irradiated adult white matter do not migrate extensively and show poor long-term survival. Exp Neurol. 164, 292-302 (2000).
- Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
- Lakatos, A., Barnett, S. C., Franklin, R. J. Olfactory ensheathing cells induce less host astrocyte response and chondroitin sulphate proteoglycan expression than Schwann cells following transplantation into adult CNS white matter. Exp Neurol. 184, 237-246 (2003).
- Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. Astrocyte-Schwann cell interactions in culture. Glia. 11, 367-377 (1994).
- Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. Chondroitin sulfate proteoglycan staining in astrocyte-Schwann cell co-cultures. Glia. 14, 145-152 (1995).
- Plant, G. W., Bates, M. L., Bunge, M. B. Inhibitory proteoglycan immunoreactivity is higher at the caudal than the rostral Schwann cell graft-transected spinal cord interface. Mol Cell Neurosci. 17, 471-487 (2001).
- Fishman, P. S., Nilaver, G., Kelly, J. P. Astrogliosis limits the integration of peripheral nerve grafts into the spinal cord. Brain Res. 277, 175-180 (1983).
- Fok-Seang, J., Mathews, G. A., ffrench-Constant, C., Trotter, J., Fawcett, J. W. Migration of oligodendrocyte precursors on astrocytes and meningeal cells. Dev Biol. 171, 1-15 (1995).
- Wilby, M. J. N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes. Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).
- Grimpe, B. The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces. Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).
- Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced. Glia. , (2010).
- Santos-Silva, A. FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis. J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).
- Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling. J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).
