Biology

ניתוח של שוואן-astrocyte אינטראקציות שימוש במבחנה מבחני

Published: January 13, 2011 doi: 10.3791/2214

Fardad T. Afshari¹, Jessica C. Kwok¹, James W. Fawcett¹

¹Cambridge Centre for Brain Repair, Department of Clinical Neurosciences, University of Cambridge

Summary

מאמר זה מתכוון לתאר באופן הדרגתי נפוץ

Abstract

בתאי שוואן אחד של תאים נפוץ אסטרטגיות לתקן בעקבות פגיעות בעמוד השדרה. בתאי שוואן מסוגלים לתמוך התחדשות axonal ומצמיח ^1,2 על ידי הפרשת גורמי גדילה ומתן לקידום צמיחה מולקולות הדבקה ³ ומולקולות תאי מטריקס ^4. בנוסף הם myelinate אקסונים demyelinated באתר של פגיעה ^5.

זאת בעקבות השתלת תאים שוואן לא להעביר מהאתר של השתל ולא להתערבב עם האסטרוציטים מארח ^6,7. התוצאה היא היווצרות של גבול חד בין התאים שוואן ואת האסטרוציטים, יצירת מכשול עבור אקסונים הגוברת מנסה לצאת בחזרה השתל לרקמת מארח proximally ו distally. האסטרוציטים במגע עם תאים שוואן גם לעבור היפרטרופיה-up להסדיר את מולקולות המעכבות ^8-13.

ב מבחני חוץ גופית שימשו מודל שוואן תאים astrocyte אינטראקציות היה חשוב בהבנת המנגנון שבבסיס ההתנהגות הסלולר.

אלה מבחני חוץ גופית כוללים assay הגבול, שם שותף תרבות נעשית באמצעות שני תאים שונים עם כל סוג תא הכובש בשטחים שונים עם פער קטן בלבד בין שני חזיתות התא. כאשר התאים להתחלק להגר, בשתי החזיתות הסלולר להתקרב זה לזה, ולבסוף מתנגשים. זה מאפשר את ההתנהגות של שתי האוכלוסיות הסלולר להיות מנותח בגבול. עוד וריאציה של הטכניקה היא אותו כדי לערבב את שתי האוכלוסיות הסלולר בתרבות לאורך זמן את שני סוגי תאים להפריד עם תאים שוואן בכבדות יחד איים בין האסטרוציטים יחד ליצירת מספר רב של שוואן-astrocyte גבולות.

Assay second המשמשים בחקר האינטראקציה של שני סוגי התאים הוא assay הגירה שבו התנועה הסלולר יכול להיות מועבר על פני השטח של סוג תא אחר monolayer ^14,15. Assay זה הידוע בכינויו assay coverslip הפוכה. בתאי שוואן הם מתורבתים על שברי זכוכית קטנים הם הפוכים עם הפנים כלפי מטה על פני השטח של monolayers astrocyte והגירה נבחנת מקצה coverslip.

מבחני שניהם כבר סייעה בחקר המנגנונים המעורבים למעט הסלולר היווצרות הגבול. חלק זיהו מולקולות באמצעות טכניקות אלה כוללות N-Cadherins 15, כונדרויטין סולפט proteoglycans (CSPGs) ^16,17, FGF / הפרין ^18, יבצע אפרים את גזר / Ephrins ^19.

בכוונת מאמר זה לתאר את הגבול ו assay assay הגירה באופן הדרגתי ולברר את הבעיות הטכניות אפשרי שעלול להתרחש.

Protocol

1. גבול Assay:

הכנה יסוד: שקופיות לשכת הם מצופים Poly-D-ליזין שקופיות הזכוכית לילה ועקר מוכנים לפני תחילת הניסוי. בינוני מוכן באמצעות מדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM), בתוספת 10% עוברי עגל בסרום (FCS), ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין-Fungizon (כוחות הביטחון הפלסטינים). גם בקבוק של תמיסת סידן / מגנזיום הנקס מלח חינם מאוזנת (HBSS) מוכנה.
ראשי שוואן עכברוש תאים בתרבית בבקבוק הם trypsinized 3 דקות באמצעות טריפסין 0.1%. תרבות ראשיים astrocyte עכברוש הוא trypsinized במשך 5 דקות באמצעות טריפסין 0.1%.
טריפסין הוא inactived ידי הוספת DMEM בתוספת FCS 10% ו 1% כוחות הביטחון הפלסטינים.
Trypsinized בתאי שוואן ואת האסטרוציטים מועברים בנפרד 15 מ"ל צינורות בז ו centrifuged ב 300 גרם במשך 5 דקות.
בתאי שוואן ואת האסטרוציטים הם מחדש מושעה בצפיפות של 2 x 10 ⁶ (ראה סעיף תוצאות נציג עבור וריאציות צפיפות התאים).
ירידה של 50 μL ההשעיה תא שוואן ממוקם בקצה אחד של PDL בארות שקופיות מצופה קאמרית. רצועת זכוכית שימש למרוח את הירידה לכיוון המרכז של החדר כדי ליצור קצה ישר. (בעזרת חותך זכוכית, coverslips זכוכית מלבני נחתכים longitudinally כך שהוא יתאים לרוחב החדר שקופיות המשמש מבחני גבול)
ירידה השנייה של μL 50 ההשעיה astrocyte הוצב בקצה השני של הבאר אותו מרוח לכיוון המרכז כדי ליצור קצה ישר במקביל למרוח את הירידה הראשון עם פער 0.2mm קטן ביניהם.
החדר שקופיות המכיל את טיפות ממוקמות בחממה ב -37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
לאחר 2 שעות, תרבויות נשטפו עם DMEM להסיר שאינם מחוברים פסולת הסלולר בינוני טרי המכיל DMEM / 10% FCS / 1% כוחות הביטחון הפלסטינים הוסיף.
הערה: DMEM / 10% FCS / 1% כוחות הביטחון הפלסטינים ניתן להוסיף forskolin (2μM) ותמצית יותרת המוח שור (BPE) (10μg / mL) לעורר התפשטות שוואן התא. BPE תספק גורמי גדילה הדרושים כדי לאפשר התרבות לטווח ארוך שוואן תאים forskolin מעלה את רמות מחזורית monophosphate אדנוזין בתוך התאים שוואן לגרום התפשטות
הם תאים בתרבית במשך כ 8-10 ימים 37 ° C, 7% CO ₂ באינקובטור. בינוני דורש להיות שונה כל 3 ימים. בשתי חזיתות התא יהיה בסופו של דבר להגיע לזה גבול חד יהוו בין שני סוגי התאים. בשלב זה הניסויים ניתן לבצע ניתוח הגורמים המעורבים ביצירת גבול.
שיתוף התרבות ניתן לתקן באמצעות פורמלדהיד 4% ותאי שוואן ניתן immunostained עם נוגדן אנטי P75 ו האסטרוציטים עם אנטי GFAP הנוגדנים לזהות את התאים בתרבית משותפת. P75 נוגדן מזהה זיקה נמוכה NGF הקולטן בתאי שוואן אשר האסטרוציטים העדר. Anti-GFAP נוגדן מזהה חלבון גליה firbrillary חומצי אשר localizes אל הציטופלסמה astrocyte. (ראה איור 1A עבור הגבול נציג)

2. הגירה Assay:

4 צלחות היטב (15mm בארות) הם PDL מצופה לילה ומוכן ליצירת monolayers astrocyte.
תרבות astrocyte ראשונית היא trypsinized במשך 5 דקות באמצעות טריפסין 0.1%. טריפסין הוא מובטל ידי הוספת DMEM בתוספת FCS 10% ו 1% כוחות הביטחון הפלסטינים לבין תא centrifuged ב 300 גרם במשך 5 דקות. (ראה תרשים 2)
האסטרוציטים הם מחדש מושעה ב 1x10 ⁵ תאים / מ"ל. 1 מ"ל של פתרון זה מתווסף מצופה כל PDL היטב 4 צלחות היטב. האסטרוציטים הם מתורבת של 24-48 שעות עד monolayer הוא ומחוברות לגמרי.
כדי להעריך הגירה תא שוואן על monolayers astrocyte, במקביל ליצירת monolayers astrocyte, מעגלי PDL מצופה זכוכית coverslips ממוקמות בתוך שפופרת 50 מ"ל ומחץ בעזרת פיפטה פלסטיק ליצירת שברים קטנים של זכוכית.
שברי זכוכית מועברים לתוך באר בצלחת 6 צלחת היטב באמצעות מלקחיים מתאים שברים בגודל נבחרים והושמו בארות אחרות. 5 שברי זכוכית ממוקמים היטב כל 6 צלחות היטב.
ראשי שוואן תאים בתרבית בקבוק הם trypsinized 3 דקות באמצעות טריפסין 0.1%. Trypsinized בתאי שוואן מועברים נפרד צינור 15 מ"ל בז ו centrifuged ב G 300 במשך 5 דקות. בתאי שוואן הם מחדש מושעה ב 2x 10 ⁶ תאים / מ"ל% DMEM/10 כוחות הביטחון הפלסטינים FCS / 1%.
20 טיפות μL ההשעיה בתאי שוואן נוסף על כל 5 שברי coverslip להציב 6 צלחות התאים היטב מודגרת ב 37 ° C CO, 7% ₂ עבור 2 שעות.
לאחר 2 שעות, התאים שוואן מחוברים שברי coverslip ו DMEM/10% FCS / 1% כוחות הביטחון הפלסטינים (בתוספת 2μM של forskolin 10μg ו / mL של BPE מתווסף גם כל כך שברי מכוסים לחלוטין עם בינוני) .
6 צלחות היטב המכיל שברי ממוקמות אז עבור 24-48 שעות בחממה עד שברי זכוכית הם con מלאשוטפת עם תאים שוואן.
לאחר שברי הם ומחוברות עם תאים שוואן, שבר כל הרים בזהירות בעזרת מלקחיים חד טבול HBSS להסיר תאים פנויים, ואז פנים הפוך על מנת monolayer astrocyte.
טוב כל כך מכוסה עם 1 מ"ל של% DMEM/10 FCS / 1% תאים כוחות הביטחון הפלסטינים לבין שוואן מותר להעביר לתקופה 24-48. במהלך תקופה זו ריאגנטים ניסיוניים כגון גורמי גדילה ניתן להוסיף על מנת להעריך את השפעתם על מספר ומרחק של הגירה של תאים שוואן.
לאחר תקופת הנדידה, שברי הזכוכית קבועים לתחתית גם כל על ידי הוספת paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 30 דקות. בעקבות קיבעון, immunostain בתאי שוואן עבור p75 (הכרה נמוכה לקולטן זיקה NGF), לאחר מכן הכתם אותם באמצעות ערכת-ABC strepavidin diaminobenzidine (DAB), כדי לאפשר ויזואליזציה של תאים שוואן תחת מיקרוסקופ אור.

3. נציג תוצאות:

לאחר 8-10 ימים שוואן-astrocyte שיתוף תרבויות להראות גבול חד בין שני סוגי התאים. גבול זה בולט יותר אם forskolin ו BPE משמש בתרבות כמו התפשטות שוואן תאים מוגברת.

אם אין גבול הוא ציין במהלך תקופה של 10 יום, זמן של התרבות ניתן להגדיל עוד יותר את הגבולות עד מבוססים. שינוי היחס בין צפיפות התאים היא דרך חלופית כדי להגביר את היווצרות הגבול. יחס של 3:01 שוואן: צפיפות התאים astrocyte ניתן להשתמש בעת הכנת תרחיפים תא ^8,18.

בעקבות immunostaining לזהות את התאים שוואן ואת האסטרוציטים, כדי להעריך את תא קו עירוב ניתן להסיק היכן הגבול הוא הקים את מספר התאים שוואן נודדים לשטח astrocyte ניתן לספור תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

להלן שתי דוגמאות של תמונות גבולות שהושגו, אחד עם הפרדה בנוי היטב בתאי שוואן ואת האסטרוציטים (איור 1A) ואחד שבו התאים לא מופרדים היטב לשטחים שונים בגלל טכניקה גרועה (איור 1B).

. איור 1 assay גבול: שוואן-astrocyte אינטראקציה. א) ביום 10 שיתוף תרבות assay בנוכחות forskolin ו BPE לעורר התפשטות שוואן תא מדגים גבול חד בין שני סוגי תאים (אדום = P75, ירוק = GFAP). ב) יום 10 שיתוף תרבות assay היכן הגבול לא נוצרו שתי חזיתות תא מעורבת. זה היה בגלל ערבוב של שתי טיפות טיפות תוך שימת תא astrocyte ו שוואן סמוכים זה לזה במהלך תקופת ההכנה של הגבול (אדום = P75, ירוק = GFAP).

איור 2. הדימוי נציג monolayer astrocyte ומחוברות

מבחני הגירה להעריך את התנועה של סוג תא אחד על פני השטח של סוג תא אחר ולכן להעריך תופעה שונה מזו של היווצרות הגבול.

תרגול נחוץ כדי להבטיח היפוך coverslips על monolayers אינה מובילה לנזק שוואן תא מכוסה שברי זכוכית monolayers astrocyte ידי מלקחיים חדה. כדי להעריך את הנדידה של תאים שוואן, המרחק המקסימלי של הגירה ואת מספר התאים נודדים מקצה coverslip ניתן למדוד במיקרוסקופ אור.

להלן תמונה של תאים שוואן מוכתם נוגדן P75 באמצעות מכתים DAB על פני השטח של monolayer astrocyte (איור 3).

איור 3
3. איור הגירה באמצעות assay assay coverslip הפוכה. א) בתאי שוואן (חום, immunostained עם נוגדן p75) נודדות הרחק בקצה coverslip. החץ מצביע על כיוון של הגירה התא הרחק coverslip.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מבחני שתוארו לעיל שימשו במחקרים שונים הוכחת את התפקיד של גורמים רבים המעורבים היווצרות הגבול בין שוואן, האסטרוציטים ומוגבל הגירה שוואן תאים בסביבה astrocytic.

הבנת המנגנונים האירועים הללו הוא חיוני כמו זה יאפשר פיתוח של אסטרטגיות כדי לייעל ולשפר את שילובם של שתלי שוואן תא הבאים השתלת ובכך להקל את היציאה של האקסונים התחדשות מאחורי השתל לרקמת הפונדקאי ומאפשר היווצרות של קשרים עם רקמה המארח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

ברצוננו להודות פיליפה וורן על עזרתה האדיבה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	41966-029
HBSS	Invitrogen	14170-088
FCS	Invitrogen	10091-148
PSF	Invitrogen	15240-062
BPE	Invitrogen	13028-014
Forskolin	Calbiochem	344273
Coverlips	VWR international	631-0149
Coverlips(rectangle)	Menzel-Glaser	BB022050A1
Chamber slides	Nalge Nunc international	177380
4 well plates, 6 well plates	Nalge Nunc international		4 well plates6 well plates
rat p75 antibody	EMD Millipore	MAB365
GFAP antibody	Dako	Z0334
Secondary antibodies (Alexa-conjugated)	Invitrogen	A-11004 A-11034	Goat anti mouse 568Goat anti Rabbit 488
Secondary biotinylated	Vector Laboratories		Goat anti mouse
DAB tablets	Sigma-Aldrich	D4418
ABC elite kit	Vector Laboratories	PK-6100
Fine Forceps	Fine Science Tools	11295-10
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6168
Fluorosave	Calbiochem	345789