Summary
Denna artikel avser att beskriva stegvis de vanligaste
Abstract
Schwann celler är en av de vanligaste cellerna i reparation strategier efter ryggmärgsskador. Schwann celler kan stödja axonal regeneration och spirande genom att utsöndra tillväxtfaktorer 1,2 och ger tillväxtfrämjande adhesionsmolekyler 3 och extracellulära molekyler matrix 4. Dessutom har de myelinate de demyelinated axoner på platsen för skadan 5.
Men efter transplantation, inte migrera Schwann celler inte från platsen för implantatet och inte blandas med värd astrocyter 6,7. Detta resulterar i bildandet av en skarp gräns mellan Schwann celler och astrocyter, vilket skapar ett hinder för växande axoner försöker avsluta ympa tillbaka till värdvävnaden proximalt och distalt. Astrocyter i kontakt med Schwann celler genomgår också hypertrofi och upp-reglera hämmande molekyler 8-13.
In vitro-analyser har använts för att modellera Schwann cell-astrocyternas interaktioner och har varit viktiga för att förstå mekanismen bakom den cellulära beteende.
Dessa in vitro omfattar gräns-analysen, där en co-kultur är gjord med hjälp av två olika celler med varje celltyp ockuperar olika territorier med endast en liten klyfta som skiljer de två cellen fronter. Eftersom cellerna dela sig och migrera, de två cellulära fronter komma närmare varandra och till slut kolliderar. Detta gör att beteendet hos de två cellpopulationer som ska analyseras vid gränsen. En annan variant av samma teknik är att blanda de två cellpopulationer i kultur och över tid de två celltyperna segregera med Schwann celler hopklumpade tillsammans som öar i mellan astrocyter tillsammans skapa flera Schwann-astrocyternas gränser.
Den andra analysen som används för att studera samspelet mellan två celltyper är övergången analysen där cellulära rörelse kan spåras på ytan av den andra celltypen monolager 14,15. Denna analysmetod är allmänt känd som inverterad täckglas analys. Schwann celler odlas på små glasbitar och de är inverterad nedåt på ytan av astrocyternas monolager och migration bedöms från kanten av täckglas.
Båda analyserna har varit avgörande för att studera mekanismer involverade i cellulära utslagning och gränsen bildas. Några av de molekyler som identifierats med hjälp av dessa tekniker är N-Cadherins 15, kondroitin proteoglykaner (CSPGs) 16,17, FGF / Heparin 18, Ef / Ephrins 19.
Denna artikel avser att beskriva gränsen analys och migration test på stegvis och belysa de eventuella tekniska problem som kan uppstå.
Protocol
1. Boundary analysen:
- Grundläggande förberedelser: Chamber bilder är belagda med Poly-D-Lysin natten och sterila glasskivor är förberedda innan experimentet. Medium är beredd att använda Dulbecco ändrade Eagles medium (DMEM), kompletterad med 10% fetalt kalvserum (FCS) och 1% Penicillin-streptomycin-Fungizon (PSF). Också en flaska Kalcium / Magnesium gratis Hanks balanserade saltlösning (HBSS) är beredd.
- Primär råtta Schwann celler odlade i kolv är trypsinized i 3 minuter med 0,1% Trypsin. Primär råtta astrocyternas kultur är trypsinized i 5 minuter med 0,1% trypsin.
Trypsin är inactived genom att lägga DMEM kompletteras med 10% FCS och 1% polyesterstapelfibrer. - Trypsinized Schwann celler och astrocyter överförs till separata 15 ml Falcon rör och centrifugeras vid 300G i 5 minuter.
- Schwann celler och astrocyter är åter avbrytas på täthet av 2 x 10 6 (se representativa resultat sektionen för variationer i celltäthet).
- 50 mikroliter droppe Schwann cellsuspension är placerad i ena änden av PDL brunnarna kammare bild. Ett glas band användes för att smutskasta den sjunka ner mot centrum av kammaren för att skapa en rak kant. (Med ett glas cutter är en rektangulär glas täckglas skär längden så att det skulle passa bredden kammare diabilder som används för gräns-analyser)
- En andra droppe 50 mikroliter av astrocyternas fjädring placerades på motsatt sida av samma väl och smetade mot mitten för att skapa en rak parallell till den första droppen smeta med en liten 0,2 mm mellanrum mellan dem.
- Kammaren bilder som innehåller den droppar placeras i inkubatorn vid 37 ° C i 2 timmar.
- Efter 2 timmar var kulturer tvättas med DMEM att ta bort de grupplösa cellulärt skräp och färsk medium som innehåller DMEM / 10% FCS / 1% polyesterstapelfibrer till.
Obs: DMEM / 10% FCS / 1% polyesterstapelfibrer kan kompletteras med Det ha (2μM) och bovin hypofysen extrakt (BPE) (10 mikrogram / ml) stimulera Schwann cellproliferation. BPE kommer att leverera tillväxtfaktorer som behövs för att långsiktigt Schwann cellkultur och Det ha höjer cykliskt adenosinmonofosfat nivåer inom Schwann celler att inducera proliferation - Cellerna odlas i cirka 8-10 dagar vid 37 ° C, 7% CO 2 inkubator. Mediet kräver att bytas var 3 dagar. De två cellen fronter når slutligen varandra och en skarp gräns kommer att utgöra mellan de två celltyper. I detta skede experiment kan utföras analysera faktorer som gräns bildas.
- Co-kultur kan fixeras med 4% formaldehyd och Schwann celler kan immunostained med anti-P75 antikropp och astrocyter med anti-GFAP antikroppar för att identifiera de celler i samarbete kulturen. P75 antikroppen känner igen låg receptor affinitet NGF på Schwann celler som astrocyter saknar. Anti-GFAP antikroppen känner igen gliaceller firbrillary surt protein som lokaliserar till astrocyternas cytoplasman. (Se figur 1A för representativ gräns)
2. Migration analysen:
- 4 brunnar (15mm brunnar) är PDL belagda natten och förbereds för att skapa astrocyternas monolager.
- Primär astrocyternas kultur är trypsinized i 5 minuter med 0,1% trypsin. Trypsin inaktiveras genom att lägga DMEM kompletteras med 10% FCS och 1% polyester och cell centrifugeras vid 300G i 5 minuter. (Se figur 2)
- Astrocyter är åter avbrytas på 1x10 5 celler / ml. 1 ml av denna lösning tillsätts varje PDL belagda väl i 4 bra tallrikar. Astrocyter är odlade i 24-48 timmar tills cellslager är helt sammanhängande.
- För att bedöma Schwann cell migration på astrocyternas monolager, parallellt med att skapa astrocyternas monolager, rund PDL-belagt glas täckglas placeras i ett 50 ml rör och krossade med hjälp av en plastpipetten att skapa små fragment av glas.
- Glassplitter överförs i en brunn i 6 brunnar skålen och med hjälp av pincetten lämplig storlek fragment väljs och placeras i andra brunnar. 5 glassplitter placeras i varje brunn i 6 brunnar.
- Primär Schwann celler odlade i kolv är trypsinized i 3 minuter med 0,1% trypsin. Trypsinized Schwann celler överförs till separata 15 ml Falcon rör och centrifugeras vid 300 G i 5 minuter. Schwann celler resuspenderas på 2x 10 6 celler / ml i DMEM/10% FCS / 1% polyesterstapelfibrer.
- 20 mikroliter droppar av Schwann celler avstängning läggs över varje 5 täckglas fragment placeras i 6 brunnar och celler inkuberas vid 37 ° C, 7% CO 2 i 2 timmar.
- Efter 2 timmar är Schwann celler bifogas täckglas fragment och DMEM/10% FCS / 1% polyesterstapelfibrer (Kompletterat med 2μM av Det ha och 10 mikrogram / ml BPE tillsätts till varje brunn så att fragmenten är helt täckt av medium) .
- Den 6 brunnar som innehåller fragment placeras sedan i inkubatorn i 24-48 timmar tills glassplitter är fullt konflytande med Schwann celler.
- När fragmenten konfluenta med Schwann celler, varje fragment plockas upp försiktigt med vass pincett och doppas i HBSS att ta bort lös celler och sedan inverterade ansiktet ner på astrocyternas monolager.
- Varje brunn täcks sedan med 1 ml DMEM/10% FCS / 1% polyester och Schwann celler tillåts att vandra i 24 till 48 under perioden. Under denna period experimentella reagens såsom tillväxtfaktorer kan läggas att bedöma deras effekt på antalet och avståndet till migration av Schwann celler.
- Efter övergångstiden, är glassplitter fast i botten av varje brunn genom att lägga till 4% paraformaldehyd (PFA) i 30 minuter. Efter fixering, immunostain de Schwann celler för p75 (erkänna låg affinitet NGF-receptorn) sedan fläcken dem med ABC strepavidin kit Diaminobenzidin (DAB), för att möjliggöra visualisering av Schwann celler under ljusmikroskop.
3. Representativa resultat:
Efter 8-10 dagar Schwann-astrocyternas co-kulturer visar en skarp gräns mellan de två celltyper. Denna gräns är mer uttalad om Det ha och BPE används i kulturen som Schwann cellproliferation förbättras.
Om ingen gräns observeras under 10 dagar, kan tidpunkten för kulturen höjas ytterligare fram gränserna är etablerade. Ändra förhållandet celltäthet är ett alternativt sätt att öka gränsen bildas. Ett förhållande på 3:1 Schwann: astrocyternas celltäthet kan användas vid beredning cellsuspensioner 8,18.
Efter immunfärgning att identifiera Schwann celler och astrocyter, att bedöma cell sammanblandningen en linje kan dras där gränsen är etablerad och antalet Schwann celler migrerar i astrocyternas territoriet kan räknas i fluorescensmikroskop.
Nedan är två exempel på bilder tagna gränser, en med välformade segregation av Schwann celler och astrocyter (Figur 1A) och en där cellerna inte har segregerade väl in i olika områden på grund av dålig teknik (Figur 1B).
. Figur 1 Boundary analysen: Schwann-astrocyternas interaktion. A) En 10 dagars co-kultur-analysen i närvaro av Det ha och BPE att stimulera Schwann cellproliferation visar en skarp gräns mellan de två celltyper (röd = P75, grön = GFAP). B) En 10 dagars co-kultur-analysen där gränsen inte bildas och två fronter cellen blandas. Detta berodde på att blanda de två droppar medan placera astrocyternas och schwanncell droppar bredvid varandra under utarbetandet av gränsen (röd = P75, grön = GFAP).
Figur 2. Representant bild av konfluenta astrocyternas monolager
Migration analyser bedöma förflyttning av en celltyp över ytan av en annan celltyp och därför bedöma ett annat fenomen sig från gränsen bildas.
Öva behövs för att garantera att vända täckglas på monolager leder inte till skador på schwanncell täckt glassplitter och astrocyternas monolager av den kraftiga pincett. För att bedöma migration av Schwann celler, det maximala avståndet migration och antalet vandrande celler från kanten av täckglaset kan mätas under ljusmikroskop.
Nedan är bilden av Schwann celler som färgats med P75-antikroppar med hjälp av DAB färgning på ytan av astrocyternas monolager (Figur 3).
Figur 3. Migration analysen med inverterade täckglas analys. A) Schwann celler (brun, immunostained med p75-antikropp) migrera bort från kanten av täckglas. Pil pekar i riktning mot cellens migration bort från täckglas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De analyser som beskrivs ovan har använts i olika studier som visar betydelsen av flera faktorer som bidrar till gränsen bildas mellan Schwann-astrocyter och begränsad Schwann cell migration i astrocytic miljö.
Att förstå mekanismerna bakom dessa händelser är nödvändigt eftersom det skulle möjliggöra utveckling av strategier för att optimera och förbättra integreringen av schwanncell transplantat efter transplantation och därmed underlätta avfarten från regenererande axoner från transplantat tillbaka till värdvävnaden tillåta bildandet av anslutningar med värden vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka Philippa Warren för hennes vänliga hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 41966-029 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170-088 | |
| FCS | Invitrogen | 10091-148 | |
| PSF | Invitrogen | 15240-062 | |
| BPE | Invitrogen | 13028-014 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344273 | |
| Coverlips | VWR international | 631-0149 | |
| Coverlips(rectangle) | Menzel-Glaser | BB022050A1 | |
| Chamber slides | Nalge Nunc international | 177380 | |
| 4 well plates, 6 well plates | Nalge Nunc international | 4 well plates6 well plates | |
| rat p75 antibody | EMD Millipore | MAB365 | |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | |
| Secondary antibodies (Alexa-conjugated) | Invitrogen | A-11004 A-11034 | Goat anti mouse 568Goat anti Rabbit 488 |
| Secondary biotinylated | Vector Laboratories | Goat anti mouse | |
| DAB tablets | Sigma-Aldrich | D4418 | |
| ABC elite kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6168 | |
| Fluorosave | Calbiochem | 345789 |
References
- Assouline, J. G. Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors. Brain Res. 428, 103-118 (1987).
- Taylor, J. S., Bampton, E. T. Factors secreted by Schwann cells stimulate the regeneration of neonatal retinal ganglion cells. J Anat. 204, 25-31 (2004).
- Reichardt, L. F. Integrins and cell adhesion molecules: neuronal receptors that regulate axon growth on extracellular matrices and cell surfaces. Dev Neurosci. 11, 332-347 (1989).
- Chiu, A. Y., Monteros,, Espinosa de los, A., Cole, R. A., Loera, S., de Vellis, J. Laminin and s-laminin are produced and released by astrocytes, Schwann cells, and schwannomas in culture. Glia. 4, 11-24 (1991).
- Blakemore, W. F. Remyelination of CNS axons by Schwann cells transplanted from the sciatic nerve. Nature. 266, 68-69 (1977).
- Andrews, M. R., Stelzner, D. J. Evaluation of olfactory ensheathing and schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord. J Neurotrauma. 24, 1773-1792 (2007).
- Iwashita, Y., Fawcett, J. W., Crang, A. J., Franklin, R. J., Blakemore, W. F. Schwann cells transplanted into normal and X-irradiated adult white matter do not migrate extensively and show poor long-term survival. Exp Neurol. 164, 292-302 (2000).
- Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
- Lakatos, A., Barnett, S. C., Franklin, R. J. Olfactory ensheathing cells induce less host astrocyte response and chondroitin sulphate proteoglycan expression than Schwann cells following transplantation into adult CNS white matter. Exp Neurol. 184, 237-246 (2003).
- Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. Astrocyte-Schwann cell interactions in culture. Glia. 11, 367-377 (1994).
- Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. Chondroitin sulfate proteoglycan staining in astrocyte-Schwann cell co-cultures. Glia. 14, 145-152 (1995).
- Plant, G. W., Bates, M. L., Bunge, M. B. Inhibitory proteoglycan immunoreactivity is higher at the caudal than the rostral Schwann cell graft-transected spinal cord interface. Mol Cell Neurosci. 17, 471-487 (2001).
- Fishman, P. S., Nilaver, G., Kelly, J. P. Astrogliosis limits the integration of peripheral nerve grafts into the spinal cord. Brain Res. 277, 175-180 (1983).
- Fok-Seang, J., Mathews, G. A., ffrench-Constant, C., Trotter, J., Fawcett, J. W. Migration of oligodendrocyte precursors on astrocytes and meningeal cells. Dev Biol. 171, 1-15 (1995).
- Wilby, M. J. N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes. Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).
- Grimpe, B. The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces. Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).
- Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced. Glia. , (2010).
- Santos-Silva, A. FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis. J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).
- Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling. J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).
