Summary
Ofrecemos un protocolo detallado para la preparación de las células primarias disociada de
Abstract
Aquí se describe un método para la preparación y el cultivo de células primarias disociada de Drosophila embriones gástrula. En resumen, una gran cantidad de embriones de moscas de la escena joven y saludable son recolectados, esterilizados, y luego físicamente disocia en una suspensión de células individuales usando un homogeneizador de vidrio. Después de estar chapada en placas de cultivo o la cámara de diapositivas en una densidad adecuada en medio de cultivo, estas células pueden diferenciarse en más de varios tipos de células morfológicamente distintas, que pueden ser identificados por sus marcadores celulares específicos. Además, se presentan las condiciones para el tratamiento de estas células con doble cadena (ds) RNA para obtener caída de genes. Eficiente ARNi en células Drosophila primaria se logra simplemente impregnando las células en medio de cultivo que contienen dsRNA. La capacidad para llevar a cabo eficaz perturbación RNAi, junto con otros molecular, análisis bioquímicos, imágenes de células, que permiten una variedad de preguntas a ser respondidas en las células de Drosophila primaria, especialmente las relacionadas con musculares diferenciadas y las células neuronales.
Protocol
1. Preparación de las jaulas de vuelo
- Crecer Drosophila (cepas de tipo salvaje como Oregon-R o cualquier genotipo) en envases convenientes tales como tazas de insectos 32-oz.
- Transferencia de las moscas recién eclosed a las grandes jaulas de recogida de embriones o volar jaulas población.
- Mover las jaulas en una habitación con una temperatura de ~ 25 ° C y la humedad ~ 65% en una luz de 12 horas y un oscuro ciclo de 12 horas para facilitar la recolección de los embriones sincrónica.
- Mantener a las moscas en las jaulas de la alimentación de ellos mató a pasta de levadura sembradas en placas de melaza. Cambiar las placas de melaza (con pasta de levadura muerta) una vez al día durante 2-3 d.
2. Recolección de los embriones síncrono
- El día de la primaria de preparación de células, se alimentan las moscas placas wth frescas bañadas en pasta de levadura muerto por un 1-2 h antes de poner punto.
- Justo antes del ciclo de 12 horas de oscuridad, sustituir las placas de pre sentar con placas de melaza fresco rayado con una mínima cantidad de pasta de levadura. Deseche la colección pre sentar, que contiene asíncrono embriones más viejos.
- Recoger los embriones durante un período de 1-2 h.
- Quitar las placas que contienen a la población relativamente sincrónica de los embriones y guárdela a 25 ° C durante 5-6 h. Los embriones serán en la etapa avanzada de gástrula en este momento.
3. Recogida y lavado de embriones
- Afloje los embriones de las placas con un pincel húmedo, y enjuagar bien con agua corriente tibia a través de una serie de tamices apilados, de modo que los embriones se acumulan en el tamiz de malla más fina en la parte inferior. Enjuagar durante unos minutos para eliminar la levadura y los restos mucho volar como sea posible.
- Consejo de los tamices para que los embriones se acumulan en un lado, y suavemente lave el tamiz en una cesta dechorionation.
- Vaya al área de tejido campana cultura sin dejar que los embriones se sequen.
4. Homogeneización de los embriones y las células de revestimiento
- Esterilizar y dechorionate los embriones mediante la inmersión en un 50% (vol / vol) de cloro durante 5-10 minutos. Enjuague los embriones de la pared de la canasta con un 70% (vol / vol) de etanol. Por otra parte, lava con lejía de embriones con agua destilada antes del tratamiento de etanol. Desde este punto en adelante los embriones deben ser tratados en condiciones de esterilidad y en el capó de cultivo de tejidos.
- Enjuague los embriones a fondo para eliminar el cloro y / o etanol con agua destilada en autoclave.
- Durante el paso de dechorionation, llenar un homogeneizador Dounce con el volumen apropiado de medio M3 de la temperatura ambiente sobre la base de la cantidad de embriones. La relación entre el volumen de los embriones y la de los medios de comunicación no debe ser mayor de embriones de 0,5 ml: 40 ml de medios (o ~ 100-200 embriones / ml).
- Colocar los embriones enjuagarse con un vaso de precipitados esterilizado con la cantidad de M3 medios de comunicación suficiente para sumergir los embriones. Deje que los embriones en remojo durante 2-5 min.
- Desmontar la canasta dechorionation y seque la malla Nitex seca con toallas de papel esterilizado.
- La transferencia de los embriones en el homogeneizador con un pincel esterilizados.
- Homogeneizar suavemente con movimientos cortos y utilizando un mortero suelto, sin llegar a la parte inferior del tubo hasta que todos los embriones se suspenden. Luego, suavemente pero con firmeza, homogeneizar con ocho golpes por completo. No tuerza la mano del mortero, ya que se mueve hacia arriba y hacia abajo.
- Transferir el homogeneizado en una solución estéril de 50 ml tubo de centrífuga cónico, ya sea por vertido o pipeta, y la tapa del tubo.
- Centrifugar durante 10 minutos a 40 g, la temperatura ambiente para que sedimenten los restos de tejido, grandes grupos de células y las membranas vitelina. Transferir el sobrenadante que contiene las células y la yema de un tubo limpio y repetir el paso de centrifugación durante 5 min.
- Transferir cuidadosamente el sobrenadante mediante el vertido o pipeta en un tubo limpio y girar durante 10 minutos a 360 gramos, la temperatura ambiente para precipitar las células. Eliminar el sobrenadante. Resuspender el botón celular en 10 ml de medio de cultivo (medio libre de suero para los experimentos de RNAi).
- Recuento de células viables mediante un hemocitómetro para estimar la densidad de las células. Mientras tanto, repita el paso 4.10 para precipitar las células.
- Resuspender las células a la concentración deseada. Para empezar, pruebe con un rango de 1 ~ 5 x 10 6 células / ml y la placa a cabo en 1,7 a 2,5 x10 5 células / cm 2.
5. Primaria de las células RNAi para las células cultivadas en una placa de 384 pocillos
- Prescindir de 5 l de dsRNAs en cada pocillo a una concentración final de ~ 250 ng por pocillo en una placa de 384 pocillos.
- Utilice una pipeta multicanal, dispensar 10 ml (1 ~ 4x106 células / ml) de pilas por pocillo en un medio libre de suero M3 en una placa de 384 pocillos que contiene un dsRNA diferentes en cada pozo. Alternativamente, las células pueden ser cultivadas en 8 y portaobjetos de vidrio de cámara para imagen confocal.
- Centrifugar las placas durante 1 minuto a 300 g, la temperatura ambiente. Cultivar las células en medio libre de suero a 25 ° C durante 22 horas o menos 18 ° C durante 1-2 d.
- Añadir 30 ml de medio de cultivo que contiene suero a cada pocillo. Centrifugar las placas durante 1 minuto a 300 g, la temperatura ambiente.
- Coloque las placas en una cámara húmeda y la cultura de las células primarias durante 5 ~ 7 días a 25 ° C.
- Imagen de las células ya sea en directo o después de la tinción de inmunofluorescencia.
6. Los resultados representativos:
En condiciones óptimas, las células de la cultura un aspecto saludable, con una morfología de todo el año. La cultura tendrá restos de células pequeñas, y de 50 a 80% confluente después de la siembra inicial. Estas células sufren cambios morfológicos después de haber sido cultivadas durante un período prolongado de tiempo. Por lo general, tarda unos 5-8 días para que las células en la cultura para ser totalmente diferenciadas a 25 ° C. Culturas de buena calidad primaria suelen ser juzgados por la forma en las células de interés se diferencian en la cultura. Por ejemplo, las células musculares primarias a menudo tienen una morfología similar a la rama y se convierten en miotubos multinucleados con banda-como las miofibrillas que consiste en una serie de sarcómeros. Miotubos completamente diferenciadas por lo general se mueven de forma espontánea en la cultura. Por el contrario, diferenciadas neuronas primarias formar grupos con sus cuerpos celulares, y conectarse con otros grupos con los cables de su axón.
Figura 1. Las células primarias sufren cambios morfológicos después de ser plateado en la cultura
(A) Una imagen de campo claro de pilas después de que se colocaron en un pocillo de una placa de 384 pocillos. La mayoría de las células son redondas y intacta y bien separadas. (B) Una imagen brillante campo de cultivo de células primarias 20 horas después de la siembra. Las células primarias ya formar grupos (grandes punta de flecha) y los músculos con una morfología similar a la rama (flecha larga) se pueden reconocer en esta etapa. (C) Una imagen de contraste de fases de cultivo primario 5 días después de la siembra. La cultura se ve mucho más avanzado, con extensiones neuronal (flechas pequeñas), los grupos neuronales (puntas de flecha grande) y músculos (de tamaño mediano flecha).
Figura 2. Ejemplos de células primarias tratados con dsRNAs cultivaron en una placa de 384 pocillos
Las células primarias fueron aisladas de los embriones que Dmef2-Gal4, D42-Gal4, UAS-mito-GFP transgenes, en el que Dmef2-Gal4 y D42-Gal4 expresión de la unidad de mito-GFP en los músculos y las neuronas motoras, respectivamente. Las células fueron tratadas con dsRNAs objetivo sea lacZ (AC) o exageradas (si) (DF). Tanto los músculos principales y las neuronas pueden ser vistos por las buenas prácticas agrarias (A, C, D, F). Las flechas blancas señalan las extensiones de las neuronas. Tinción phalloidin de actina (puntas de flecha) revela una estructura músculo-sucursal como en el cultivo tratado con lacZ dsRNAs (B y C), pero vuelta a la morfología del músculo en el cultivo tratado con si dsRNAs (E y F). En las imágenes fusionadas (C, F), los músculos son manchas amarillas, pero el rojo neuronas muestra negativa y sus extensiones (flechas blancas).
Figura 3. Micrografías confocal de los músculos principales cultivos en la salud humana vitronectina revestida de diapositivas cubierta de vidrio
Principales músculos fueron teñidas con anti-immunofluorescently Drosophila Titin (KZ) (rojo en la mezcla) y con phalloidin para actina (verde en la fusión). Los paneles superiores son el control muscular de tipo salvaje y las de abajo son los préstamos para ajuste estructural (CG31374) músculo RNAi con sarcómeros acortados.
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Discussion
El patrón de desarrollo de los cultivos primarios de células de Drosophila puede variar mucho, posiblemente debido a las diversas variables durante el proceso de preparación de células primarias. En primer lugar, las moscas utilizadas para la puesta de huevos deben ser pequeños (menos de una semana de edad) y sanos (libres de la infección viral o bacteriana). Embriones fertilizados o infectado se debe evitar, ya que son inútiles, y las células derivadas de los embriones que no se puede diferenciar y sólo podrá sobrevivir durante 1-2 días. En segundo lugar, durante el proceso de homogeneización, es importante no sobrecargar el homogeneizador con embriones de más. La sobrecarga del homogeneizador con embriones demasiados provocará un aumento en la cantidad de desechos y el número de células muertas, lo que eventualmente pondrá en peligro la diferenciación celular. Finalmente, las células deben ser chapada a una densidad apropiada para asegurar una buena diferenciación de las células primarias. Encontramos que la diferenciación de las neuronas y células musculares se reduce drásticamente cuando las células primarias se siembran inicialmente a una densidad demasiado alta.
Para el análisis fenotípico, placas 384-así se suelen utilizar para hacer crecer células primarias para la detección o análisis de imágenes con un aumento menor. Las imágenes con un aumento mucho mayor y una mejor resolución se puede lograr mediante las células que crecen en un portaobjetos de vidrio cubierta de la cámara, seguido de imágenes ya sea en vivo o células teñidas utilizando un microscopio confocal. Como la mayoría de las células primarias son adherentes, el área de las células que crecen en el pozo de la cámara de diapositivas debe ser utilizado como una guía para la estimación tanto del número de células y la cantidad de medio para cada bien. Además, la cubierta de vidrio-cámara de diapositivas puede ser recubierta con la matriz extracelular (ECM) de proteínas, tales como vitronectina humana, laminina y colágeno IV para permitir la diferenciación de las células de interés. Por ejemplo, los músculos principales diferencian poco de los no revestidos cubierta de vidrio, pero también en el ECM-revestidos cubierta de vidrio. Finalmente, con el fin de reducir la autofluorescencia emitida por medio de la cultura, el medio de cultivo regular, como escudo y M3 Sang, debe ser reemplazado con un elevado de buffer salina fisiológica, como HL6, justo antes de la imagen.
En principio, este protocolo se puede utilizar para la preparación de las células primarias de las moscas con los genotipos, como stocks de homocigotos mutantes viables y fértiles, y de aquellos cuyos embriones se pueden seleccionar de forma manual o mediante un clasificador basado en la expresión de la GFP, o expresar tejidos específicos Gal4, UAS-gen X genotipos. En combinación con otros métodos de experimentación, este protocolo permite una variedad de cuestiones que debían abordarse, especialmente aquellos que están relacionados con las células diferenciadas como neuronas y músculos, y son difíciles de abordar en las líneas celulares cultivadas.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
JB fue apoyada por el Damon Runyon Cancer Research Fellowship Foundation DRG-1716-02. JZ fue apoyado por el NIH / NIGMS F32 Fellowship GM082174-02. NP es un investigador del Instituto Médico Howard Hughes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| #25 US standard testing sieve | VWR international | 57334-454 | |
| #45 US standard testing sieve | VWR international | 57334-462 | |
| #120 US standard testing sieve | VWR international | 57334-474 | |
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR international | 62400-620 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0040 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0100 | |
| Costar, 384-well plate | VWR international | 29444-078 | |
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
References
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Laboratory culture of Drosophila. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth. Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).
- Bai, J. RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance . Development. 135, 1439-1449 (2008).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Donady, J. J., Fyrberg, E. Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro. TCA Manual. 3, 685-687 (1977).
- Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae. Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).
- Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening. Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).
