Summary
Мы предоставляем подробный протокол для подготовки первичных элементов отделены от
Abstract
Здесь мы опишем способ получения и культивирования первичных элементов отделены от эмбрионов дрозофилы гаструлы. Короче говоря, большое количество постановочных эмбрионов из молодых и здоровых мух собираются, стерилизовать, а затем физически распадается на суспензии отдельных клеток с использованием стеклянного гомогенизатора. После того, как при посеве на культуру пластин или камеры слайды на соответствующей плотности в культуральной среде, эти клетки могут дифференцироваться в дальнейшем несколько морфологически-различных типов клеток, которые могут быть определены их специфические маркеры клеток. Кроме того, даны условия для лечения этих клеток с двухцепочечной (DS) для выявления РНК гена нокдаун. Эффективное RNAi у дрозофилы первичных элементов осуществляется просто купание клеток в дсРНК содержащей культуральной среде. Способность осуществлять эффективное возмущение RNAi, вместе с другими молекулярными, биохимических, клеточных анализ изображений, позволит разнообразные вопросы, требующие ответа у дрозофилы первичных элементов, особенно связанных с дифференцированным мышц и нервных клеток.
Protocol
1. Подготовка летать клетки
- Расти дрозофилы (штаммов дикого типа, таких как Орегон-R или любой генотип) в удобных контейнерах, таких как 32-унций чашки насекомое.
- Передача новых eclosed летит в большом эмбриона сбора клеток или летать населения клетках.
- Перемещение клеток в комнате с температурой ~ 25 ° С и влажность ~ 65% в свет 12-ч и темных 12-часовой цикл, чтобы облегчить сбор синхронной эмбрионов.
- Поддерживать летит в клетках, кормя их убили дрожжи пасты штрихом на патоке пластин. Изменение патоки пластин (с убитыми дрожжами пасты) один раз в день в течение 2-3 d.
2. Сборник синхронных эмбрионов
- В день первичного ячейки подготовки, кормить мух т-й свежие пластины покрыты убитых дрожжей паста для 1-2 ч заранее заложить период.
- Незадолго до 12-ч темно цикла, заменить предварительно лежали плиты с свежих пластин патоки с прожилками минимальное количество дрожжей пасты. Отмена предварительной лежала коллекция, которая содержит асинхронный старше эмбрионов.
- Сбор эмбрионов в течение 1-2 ч.
- Удалить чашки, содержащие относительно синхронного населения эмбрионов и хранить при температуре 25 ° С в течение 5-6 ч. Эмбрионы будут в продвинутой стадии гаструлы в это время.
3. Сбор и промывка эмбрионов
- Ослабить эмбрионов из пластин с мокрой кистью, и тщательно промыть теплой водой через кран сложены набор сит, таким образом, чтобы эмбрионы собирают в лучших сито в нижней части. Промыть в течение нескольких минут, чтобы удалить как можно больше дрожжей и летать мусора насколько это возможно.
- Совет сита, так что эмбрионы накапливаются на одной стороне, и аккуратно мыть их от сито в dechorionation корзине.
- Переход на капот области культуры ткани, не давая высохнуть эмбрионов.
4. Усреднение эмбрионов и клеток покрытием
- Стерилизовать и dechorionate эмбрионов путем погружения их в 50% (об / об) отбеливателя в течение 5-10 мин. Промыть эмбрионы от стены из корзины с 70% (об / об) этанола. Кроме того, мытье отбеливателя от эмбрионов с дистиллированной водой перед этанолом лечения. С этого момента эмбрионы должны содержаться в стерильных условиях и в капюшоне культуры ткани.
- Промыть эмбрионы полностью, чтобы удалить отбеливателем и / или этанол с автоклавного дистиллированной воды.
- Во время dechorionation шаг, заполните Dounce гомогенизатор с соответствующим объемом комнатной температуре M3 среды на основе количества эмбрионов. Соотношение между объемом эмбрионов и, что СМИ не должно быть более 0,5 мл эмбрионов: 40-мл средствах массовой информации (или ~ 100-200 эмбрионов / мл).
- Место промыть эмбрионов в стерилизованные стакан с количеством M3 средств массовой информации достаточно, чтобы погрузить эмбрионов. Пусть эмбрионов впитаться в течение 2-5 мин.
- Разберите dechorionation корзины и промокните сетки Nitex сухие стерилизованные с бумажными полотенцами.
- Трансфер эмбрионов в гомогенизаторе с стерилизовать кисти.
- Однородный осторожно короткие удары с использованием свободно пестиком, не достигнув нижней части трубки, пока все эмбрионы приостановлено. Затем осторожно, но твердо, гомогенизации с восемью полный инсультов. Не крутите пестиком, как она движется вверх и вниз.
- Передача гомогената в стерильные 50-мл коническую трубку центрифуги либо путем заливки или пипетки, и крышка трубки.
- Центрифуга течение 10 мин при 40 г, комнатной температуры до гранул ткани мусора, большие скопления клеток и желточной мембраны. Передача супернатант, содержащий клетки и желток в чистую пробирку и повторите шаг центрифугирования в течение 5 мин.
- Тщательно передачи супернатанта путем заливки или пипеткой в чистую пробирку и спин течение 10 мин при 360 г, комнатной температуры до гранул клеток. Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл питательной среды (бессывороточной среде для экспериментов RNAi).
- Граф жизнеспособных клеток с использованием гемоцитометра оценить плотность клеток. Между тем, повторите шаг 4,10 для осаждения клеток.
- Ресуспендируют клетки желаемой концентрации. Для начала, попробуйте диапазоне 1 ~ 5 × 10 6 кл / мл и пластины из 1,7 до 2,5 x10 5 клеток / см 2.
5. Первичная-клеточной РНК-интерференции для клеток, выращенных на 384-луночного планшета
- Разлить по 5 мкл dsRNAs в каждую лунку в конечной концентрации ~ 250 нг на лунку в 384-луночного планшета.
- Использование многоканальной пипетки, внесите 10 мл (1 ~ 4x106 кл / мл), первичных клеток на лунку в бессывороточной M3 среды в 384-луночного планшета содержащих различные дсРНК в каждую лунку. Кроме того, клетки можно культивировать на 8-а стеклянную камеру слайды для конфокальной микроскопии.
- Центрифуга пластин в течение 1 мин на 300 г, комнатной температуры. Культуры клеток в бессывороточной среде при 25 ° С в течение 22 ч или при 18 ° С в течение 1-2 d.
- Добавить 30 мл сыворотки культуральной среде, содержащей в каждую лунку. Центрифуга пластин в течение 1 мин на 300 г, комнатной температуры.
- Место пластин во влажной камере и культуры первичных ячеек для дополнительных 5 ~ 7 дней при температуре 25 ° C.
- Изображение клетки в прямом эфире или после иммунофлуоресцентного метода.
6. Представитель Результаты:
В оптимальных условиях клетки в культуре будет выглядеть здоровым с круглым морфологии. Культуры будет мало мусора ячейки, а на 50 ~ 80% сливной после первоначального покрытия. Эти клетки претерпевают морфологические изменения после того, культивировали в течение длительного периода времени. Обычно это занимает около 5-8 дней для клеток в культуре, чтобы быть полностью дифференцированных при 25 ° C. Хорошее качество первичных культур, как правило, судят по тому, как клетки интересов, дифференцируются в культуре. Например, первичные мышечные клетки часто имеют отраслевые, как морфология и становятся многоядерными myotubes с полосой типа миофибрилл, состоящий из серии саркомеров. Полностью дифференцированные myotubes, как правило, спонтанно двигаться в культуре. В отличие от дифференцированных первичных нейронов образуют кластеры, их тела клетки, и общаться с другими кластерами с кабелями аксона.
Рисунок 1. Первичные клетки претерпевают морфологические изменения после того, как покрытие в культуре
(А), яркое изображение области первичных элементов сразу же после покрытием в скважине 384-луночного планшета. Большинство клеток округлые и неповрежденными и хорошо разделены. (B) яркое изображение области первичной культуры клеток через 20 часов после покрытия. Первичные элементы уже образуют кластеры (большая стрелка) и мышцах с филиалом морфологией (длинная стрелка), могут быть признаны на данном этапе. (C) фазового контраста изображения первичной культуры через 5 дней после покрытия. Культура выглядит гораздо более продвинутые, с нейронными расширений (маленькие стрелки), нейронных кластеров (большая наконечники стрел) и мышц (средние стрелки).
Рисунок 2. Примеры первичных клеток, обработанных dsRNAs культивируют в 384-луночного планшета
Первичные клетки были выделены из эмбриона проведения Dmef2-Gal4, D42-Gal4, UAS-мито-GFP трансгенов, в котором Dmef2-Gal4 и D42-Gal4 диск выражение мито-GFP в мышцах и моторные нейроны, соответственно. Клетки обрабатывали dsRNAs ориентации либо LacZ (AC) или завышенных (если) (DF). Обе первичные мышц и нейронов можно увидеть, GFP (А, С, D, F). Белые стрелки указывают на нейронных расширений. Фаллоидином окрашивание актина (наконечники стрел), показывает, отраслевые как мышечные структуры в культуре получавших LacZ dsRNAs (В и С), но облавы мышц морфологии культуры получавших если dsRNAs (E и F). В объединенном изображений (C, F), мышцы окрашиваются желтым, красным, но отрицательный нейроны шоу и их расширений (белые стрелки).
Рисунок 3. Конфокальной микроскопии первичной мышцах, культивируемые на человека витронектин покрытием слайды покровного стекла
Первичная мышцы immunofluorescently окрашивали анти-дрозофилы Titin (KZ) (красный слияния) и с фаллоидином для актин (зеленый слияния). Верхней панели дикого типа мышечный контроль и нижние являются соли, (CG31374) RNAi мышц с укороченным саркомеров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Развития, структура первичной культуры клеток дрозофилы может сильно варьироваться, возможно из-за нескольких переменных во время первичного процесса подготовки клетки. Прежде всего, мух для откладки яиц должна быть молодым (в течение недели назад) и здоровый (без вирусной или бактериальной инфекции). Неоплодотворенные или зараженных эмбрионов следует избегать, поскольку они бесполезны и клетки, полученные из этих эмбрионов не могут дифференцироваться и только выживать в течение 1-2 дней. Во-вторых, в процессе гомогенизации процесса, важно не перегружать гомогенизатора со слишком большим количеством эмбрионов. Перегрузка гомогенизатора со слишком большим количеством эмбрионов приведет к увеличению количества мусора и число мертвых клеток, которые, в конечном счете компромисс клеточной дифференцировки. Наконец, камеры должны быть покрыты при соответствующей плотности, чтобы обеспечить хорошую дифференциацию первичных элементов. Мы обнаружили, что дифференциация обоих нейронов и мышечных клеток резко снижается, когда первичные клетки высевают сначала на слишком высокой плотности.
Для фенотипического анализа, 384-луночный, как правило, используются для выращивания первичных клеток для скрининга или изображений анализа на более низком увеличении. Изображения с более высоким увеличением и более высокое разрешение может быть достигнуто за счет растущих клеток на кавер-стеклянную камеру слайд, после чего изображение в прямом эфире или окрашенных клеток с помощью конфокальной микроскопии. Поскольку большинство первичной клетки единомышленником, площадь для выращивания клеток и камерной слайды должны использоваться в качестве ориентира для оценки как по числу клеток и количество среды, необходимых для каждой скважины. Кроме того, кавер-стеклах камеры могут быть покрыты внеклеточного матрикса (ECM), белки, такие как человеческий витронектин, ламинин или коллагена IV, чтобы дифференцировки клеток-правовой интерес. Например, первичные мышцы дифференцировать плохо на не-мелованной обложкой стекла, а также на ECM-мелованной обложкой стекла. Наконец, в целях снижения аутофлюоресценция излучаемый культуральной среды, регулярной среде культуры, такие как щит и Санг M3, должны быть заменены летать физиологического раствора буфера, такие как HL6, прямо перед изображениями.
В принципе, этот протокол может быть использован для подготовки первичных клеток от мух с любым генотипы, например, из гомозиготных жизнеспособной и плодородные мутант запасов, а из тех, чьи эмбрионы могут быть выбраны вручную или с помощью сортировщика на основе выражения GFP, или выразить тканеспецифические Gal4, UAS-ген Х генотипов. В сочетании с другими методами экспериментов, этот протокол позволит круг вопросов, подлежащих рассмотрению, особенно те, которые связаны с дифференцированной клетки, такие как нейроны и мышц, и их трудно решать в культивируемых клеточных линий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
JB была поддержана Дэймон Руньона Cancer Research стипендии Фонда DRG-1716-02. JZ была поддержана NIH / NIGMS стипендий F32 GM082174-02. Н. П. является следователь Медицинского института Говарда Хьюза.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | |
| #25 US standard testing sieve | VWR international | 57334-454 | |
| #45 US standard testing sieve | VWR international | 57334-462 | |
| #120 US standard testing sieve | VWR international | 57334-474 | |
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR international | 62400-620 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0040 | |
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0100 | |
| Costar, 384-well plate | VWR international | 29444-078 | |
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
References
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Laboratory culture of Drosophila. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth. Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).
- Bai, J. RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance . Development. 135, 1439-1449 (2008).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Donady, J. J., Fyrberg, E. Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro. TCA Manual. 3, 685-687 (1977).
- Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae. Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).
- Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening. Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).
