Summary
هذا الفيديو يوضح التقنيات العامة المستخدمة لالأنوفيلة الغامبية الخلفي في المختبر. وأثبتت الأساليب لرعاية البعوض المختبرات من خلال جميع مراحل دورة حياة الكائن الحي من اليرقات إلى الشرانق لتغذية الدم الكبار.
Abstract
يصف هذا البروتوكول تربية البعوض في insectary. يتم الحفاظ على غرف insectary في 28 درجة مئوية والرطوبة 80 ٪ ~ ، مع 12 ساعة. اليوم / دورة الليل. لهذا الإجراء ، ستحتاج أقفاص البعوض ، 10 ٪ محلول السكروز العقيمة ، والمناشف الورقية ، دورق ، whatman رقة الترشيح ، مغذيات الزجاج ، ومصل دم الإنسان وحمام المياه ، parafilm ، الماء المقطر ، والصواني البلاستيكية النظيفة والغذاء البعوض (وصفه أدناه) ، والبعوض صافي لتغطية الصواني ، والفراغ ، وغرفة لجمع جمع الكبار.
Protocol
البعوض الغذائية :
- الغذاء ج : أسس الغذاء الأسماك (Aquaricare). ألف قرص صغير يحتاج إلى إضافته.
- الغذائية ب : أسس الغذاء لجنة مناهضة التعذيب (بورينا). ألف قرص صغير يحتاج إلى إضافته.
- الغذاء C : القط الغذاء (بورينا). قرصين يحتاج إلى إضافته.
الدم :
ويمكن استخدام الحيوانات أو البعوض إلى دم الإنسان الخلفي. ويتم جمع الدم الطازج مع حقنة وضعت في أنبوب معقم 15 مل تحتوي على فالكون 1ml من CPD (تخثر) لكل 10 مل من الدم ، مختلطة ثم بلطف وطرد في درجة حرارة الغرفة على 2000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. يتم تجاهل طاف ، مع الحرص على إزالة الطبقة الشهباء الذي يضم خلايا الدم الأخرى (مثل WBC). ومن ثم علق بيليه RBC في حجم مساو من قبل pipetting RPMI المتوسطة ، وغسلها أخرى في هذا ثلاث مرات المتوسط. بعد غسل النهائي ، ومعلق في كرات الدم الحمراء في مكعبات حجم مساو من RPMI المتوسطة وتخزينها في 4 درجات مئوية (يمكن أن تبقى لمدة 8-10 أيام). قبل الرضاعة ، وطرد من ربك (في RPMI) (2000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق) لتكوير أسفل الخلايا ، ومعلق في RBC معبأة في المصل (O + مصل بشري) للحصول على الهيماتوكريت 40 ٪. يجب أن يبقى في الدم عند 37 درجة مئوية دائما للتغذية.
DAY 1 :
- تتغذى على البعوض 3-5 اليوم البالغين من العمر الإناث على الدم لوضع البيض.
- لتغذية الدم ، يتم استخدام طريقة مصطنعة غشاء التغذية (parafilm) على النحو التالي :
- تختلط خلايا الدم الحمراء (انظر أعلاه لإعداد الدم) مع المصل الحرارة المعطل للحصول على الهيماتوكريت ~ 40 ٪ (40 ٪ معبأة RBC ومصل الدم 60 ٪). يضاف ذلك إلى تغذية الزجاج.
- توصيل وحدة التغذية إلى المياه الدافئة ، سترة (37 درجة مئوية) ، وتوضع على قفص للسماح بالوصول البعوض على سطح الغشاء.
- يسمح للبعوض لتغذية لمدة 30 دقيقة ~.
اليوم 3 :
- والإناث تضع البيض بعد يومين تتغذى على الدم. يتم وضع ورقة صغيرة ملفوفة في تصفية شكل مخروطي في كوب صغير يحتوي على الماء المقطر ، والتأكد من أن يحصل مرشح ورقة رطبة. يتم الاحتفاظ الدورق داخل القفص ليلة وضحاها البعوض لوضع البيض.
اليوم 4 :
- يتم وضع ورقة الترشيح التي تحتوي على بيض البعوض في علبة بلاستيكية بالماء المقطر 300 مل ~. وقليل من الطعام ويضاف إلى الدرج ويسمح ليفقس البيض إلى اليرقات خلال الايام القليلة المقبلة.
5 أيام -- 8 :
- ويتم تغذية يرقات تزداد كل يوم مع اثنين من أقراص سي الغذائية ومراقبتها لكثافة والسكان. في اليوم الثامن (اليرقات البالغة من العمر 5 أيام) ، وتضعف السكان اليرقات من 1 إلى درج الصواني 10 ~ ، مع قليل من الغذاء وقرصين من C الغذائي في كل درج. (~ 30 دقيقة)
يوم 9 -- 12 :
- ويتم تغذية يرقات كل يوم مع جيم الغذاء في اليوم 12th (9 اليرقات يوم من العمر) ، يتم تغيير المياه مع المياه العذبة ، وإضافة المواد الغذائية (B قليل من الطعام وقرصين من C الغذاء). ويبدأ الشرانق النامية في هذه المرحلة. وتغطي شبكات مع الأدراج لتجنب هروب الكبار. (~ 80-10 دقيقة)
يوم 13 -- 15 :
يسمح للعذارى في الظهور بين الكبار ل2 التالي -- 3 أيام. يعطى الغذاء كل يوم إلى يرقات / الشرانق عن طريق إزالة بعناية لتجنب هروب الصافي من البالغين.
اليوم 16 :
- يتم جمعها من البالغين في قفص من خلال الشافطة متصلة فراغ. القفص عبارة عن زجاجة صغيرة 100 مل مع فتيلة القطن التي يتم نقعها مع السكروز 10 ٪ (تعقيمها) وبطانة منشفة ورقية على الجزء السفلي لامتصاص أي انسكابات السكر المحتملة التي قد تحدث أثناء التعامل مع القفص. (~ دقائق 30-40)
اليوم 17 -- 21 :
- ثم يتم الاحتفاظ من البالغين (ذكور واناث) في غرفة insectary لأيام 4-5 ، يتغذى على السكروز 10 ٪ مرة أخرى قبل أن يتم تغذيتها بالدم لبدء الدورة القادمة. يمكن استخدام نفس البعوض لوضع البيض أكثر من مرة.
- ويمكن قتل البعوض الذي ليست هناك حاجة لاجراء تجارب تربية أو عن طريق وضع القفص في الفريزر. الأدراج والأقفاص المستخدمة تحتاج إلى تنظيفها وتجفيفها قبل أن يمكن استخدامها مرة أخرى.
ملاحظة : يمكن أن يكون هناك بعض الاختلافات في طريقة تربية البعوض ومختبرات مختلفة قد تكون التقنيات المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Food A | Aquaricare | Grounded fish food. A small pinch needs to be added. | ||
| Food B | Purina | Grounded cat food. A small pinch needs to be added. | ||
| Food C | Purina | Cat food. Two tablets needs to be added | ||
| RBC | prepared red blood cells: 40% hematocrit in human serum | |||
| RPMI | Medium | |||
| CPD | anticoagulant | |||
| serum | O+ human serum | |||
| Mosquito feeder | ||||
| parafilm | ||||
| Anopheles gambiae | mosquitos | |||
| 10% sucrose | mosquito food | |||
| insectary |
References
- Bangs, M. J., Soelarto, T., Barodji,, Wicaksana, B. P., Boewono, D. T. Colonization of Anopheles maculatus from Central Java, Indonesia. J Am Mosq Control Assoc. 18, 359-363 (2002).
- Beier, M. S., Beier, J. C., Merdan, A. A., el Sawaf, B. M., Kadder, M. A. Laboratory rearing techniques and adult life table parameters for Anopheles sergentii from Egypt. J Am Mosq Control Assoc. 266, 266-270 (1987).
- Benedict, M. Q. Care and maintenance of anopheline mosquitoes, The molecular biology of disease vectors: A methods manual. Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. , Champman & Hall. London. 3-12 (1997).
- Casanges, A. H., Mcgovran, E. R., Chiles, J. V. Rearing of Anopheles quadrimaculatus Say and Aedes aegypti (L.) in the laboratory. Mosq News. 9, 112-117 (1949).
- Merritt, R. W., Dadd, R. H., Walker, E. D. Feeding behavior, natural food and nutritional relation ships of larval mosquitoes. Annual Rev. Entomol. 37, 349-376 (1992).
- Nasirian, H., Ladonni, H. Artificial bloodfeeding of Anopheles stephensi on a membrane apparatus with human whole blood. J Am Mosq Control Assoc. 22, 54-56 (2006).
- Ng'habi, K. R., John, B., Nkwengulila, G., Knols, B. G., Killeen, G. F., Ferguson, H. M. Effect of larval crowding on mating competitiveness of Anopheles gambiae mosquitoes. Malar J. 30 (4), 49 (2005).
- Stobart, R. H. Factors affecting the control of body volume in the larvae of the mosquitoes Aedes aegypti and Aedes detritus. Edw. J. Exp. Boil. 54, 67-82 (1971).
