Summary
Bu video, laboratuarda arka Anofel gambiae kullanılan genel teknikler gösterilmektedir. Kan besleme yetişkin için pupa larva organizmanın yaşam döngüsünün tüm aşamalarında laboratuar sivrisinek bakımı için yöntemleri gösterilmektedir.
Abstract
Bu protokol insectary sivrisinek yetiştirme açıklamaktadır. Insectary odalar 28 korunur ° C ve 12 saat ~% 80 nem,. gece / gündüz döngüsü. Bu işlem için, sivrisinek kafes,% 10 steril sakaroz çözeltisini, kağıt havlu, beher, Vatmanlar filtre kağıdı, cam besleyiciler, insan kan ve serum, su banyosu, parafilm, distile su, temiz bir plastik tepsiler, sivrisinek gıda (tarif gerekir aşağıda), yetişkin toplamak için tepsiler, vakum, ve bir toplama haznesinin kapağı net sivrisinek.
Protocol
Sivrisinek gıda:
- Gıda A: balık yemi (Aquaricare). Küçük bir tutam eklenmesi gerekiyor.
- Gıda B: CAT gıda (Purina) topraklanmalıdır. Küçük bir tutam eklenmesi gerekiyor.
- Gıda C: kedi maması (Purina). Iki tablet eklenmesi gerekiyor.
Kan:
Hayvan veya insan kanı arka sivrisinekler için kullanılabilir. Taze kan bir şırınga ile toplanır ve her 10 ml kan CPD (antikoagülan) 1 ml içeren steril 15 ml Falcon tüp koymak, sonra hafifçe karıştırılır ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2000 rpm'de santrifüj. Diğer kan hücrelerinin (örneğin WBC) oluşur buffy coat kaldırmak için özen Süpernatant atılır. RBC pelet sonra pipetleme RPMI medyum eşit hacmi askıya daha bu orta üç kere yıkanır. Son yıkamadan sonra, pelet eritrositlerde RPMI orta eşit hacmi yeniden süspanse ve 4 saklanan ° C (8-10 gün süreyle muhafaza edilebilir). RBC (RPMI) beslemeden önce, hücreleri aşağı pelet santrifüj (5 dakika için 2000 rpm), ve dolu RBC% 40 hematokrit elde etmek için serum (O + insan serum) yeniden bekletildi. Kan ° C her zaman beslenme için 37 tutulmalıdır.
1. GÜN:
- 3-5 gün eski yetişkin dişi sivrisinekler yumurtalarını bırakmak için kan beslenir.
- Kan beslenmesi için, yapay bir zar (parafilm) besleme yöntemi aşağıdaki gibi kullanılır:
- Kırmızı kan hücreleri (kan hazırlanması için yukarıya bakın) ~% 40 hematokrit (RBC% 40 ve% 60 serum dolu) elde etmek için ısı ile inaktive edilmiş serum karıştırılır. Bu cam besleyici eklenir.
- Besleyici, sıcak (37 ° C) su-ceket bağlı ve membran yüzeyine sivrisinek erişime izin vermek için kafes yerleştirilir.
- Sivrisinekler ~ 30 dakika boyunca beslemek için izin verilir.
3. GÜN:
- Kanı ile beslenirler iki gün sonra dişiler yumurtalarını olacaktır. Konik bir şekil sarılmış küçük bir filtre kağıdı, filtre kağıdı nemli alır emin, distile su içeren küçük bir behere konur. Beher, sivrisinekler yumurtalarını bırakmak için için bir gecede kafes içinde tutulur.
4. GÜN:
- Sivrisinek yumurta içeren filtre kağıdı ~ 300 ml distile su ile plastik bir tepsiye yerleştirilir. Bir tutam gıda tepsiye eklenir ve bir sonraki gün boyunca larva yumurtadan yumurta izin verilir.
5 - 8 GÜN:
- Büyüyen larvalar her gün iki tablet gıda C ile beslenen, ve yoğunluğu ve nüfus açısından izlenmelidir. Sekizinci gün (5 gün yaşlı larva), larva nüfus, her tepsi yiyecek gıda C, A ve iki tablet bir tutam, 1 tepsi ~ 10 tepsileri seyreltilir. (~ 30 dakika)
9 - 12 GÜN:
- Larvaları, 12. gün (9 gün yaşlı larva) gıda C. her gün beslenir, su, taze su ile değiştirildi ve gıda (gıda ve gıda C iki tablet bir tutam) eklenir. Pupa, bu aşamada gelişen başlar. Tepsiler yetişkinlerin kaçmasını önlemek için ağları ile kaplıdır. (~ 8-10 dakika)
GÜN 13 - 15:
Pupa sonraki 2 - 3 gün yetişkin için ortaya çıkmasına izin verilir. Gıda larva / pupa yetişkin kaçmasını önlemek için dikkatle net kaldırarak her gün verilir.
GÜN 16:
- Vakum bağlı bir aspiratör ile yetişkin bir kafes içine toplanır. Kafesi,% 10 sakaroz (otoklava) ve alt kafes taşıma sırasında oluşabilecek herhangi bir potansiyel şeker dökülen emmek için bir kağıt havlu astar ile ıslatılmış bir pamuk fitil ile küçük bir 100 ml şişe oluşur. (~ 30-40 dak.)
GÜN 17 - 21:
- Yetişkin (erkekler hem de kadınlar), daha sonra sonraki döngü yeniden başlamak için kan ile beslenen önce% 10 sakaroz beslenen, 4-5 gün boyunca insectary oda saklanır. Aynı sivrisinekler yumurtalarını bırakmak için bir kereden fazla kullanılabilir.
- Deneyler veya yetiştirme için gerekli değildir sivrisinek kafes koyarak dondurucuda öldürülen olabilir. Kullanılan tepsiler ve kafesler tekrar kullanılmadan önce temizlenmeli ve kuru olması gerekir.
NOT: sivrisinek yetiştirme yönteminde bazı farklılıklar olabilir ve farklı laboratuvarlar farklı teknikler olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Food A | Aquaricare | Grounded fish food. A small pinch needs to be added. | ||
| Food B | Purina | Grounded cat food. A small pinch needs to be added. | ||
| Food C | Purina | Cat food. Two tablets needs to be added | ||
| RBC | prepared red blood cells: 40% hematocrit in human serum | |||
| RPMI | Medium | |||
| CPD | anticoagulant | |||
| serum | O+ human serum | |||
| Mosquito feeder | ||||
| parafilm | ||||
| Anopheles gambiae | mosquitos | |||
| 10% sucrose | mosquito food | |||
| insectary |
References
- Bangs, M. J., Soelarto, T., Barodji,, Wicaksana, B. P., Boewono, D. T. Colonization of Anopheles maculatus from Central Java, Indonesia. J Am Mosq Control Assoc. 18, 359-363 (2002).
- Beier, M. S., Beier, J. C., Merdan, A. A., el Sawaf, B. M., Kadder, M. A. Laboratory rearing techniques and adult life table parameters for Anopheles sergentii from Egypt. J Am Mosq Control Assoc. 266, 266-270 (1987).
- Benedict, M. Q. Care and maintenance of anopheline mosquitoes, The molecular biology of disease vectors: A methods manual. Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. , Champman & Hall. London. 3-12 (1997).
- Casanges, A. H., Mcgovran, E. R., Chiles, J. V. Rearing of Anopheles quadrimaculatus Say and Aedes aegypti (L.) in the laboratory. Mosq News. 9, 112-117 (1949).
- Merritt, R. W., Dadd, R. H., Walker, E. D. Feeding behavior, natural food and nutritional relation ships of larval mosquitoes. Annual Rev. Entomol. 37, 349-376 (1992).
- Nasirian, H., Ladonni, H. Artificial bloodfeeding of Anopheles stephensi on a membrane apparatus with human whole blood. J Am Mosq Control Assoc. 22, 54-56 (2006).
- Ng'habi, K. R., John, B., Nkwengulila, G., Knols, B. G., Killeen, G. F., Ferguson, H. M. Effect of larval crowding on mating competitiveness of Anopheles gambiae mosquitoes. Malar J. 30 (4), 49 (2005).
- Stobart, R. H. Factors affecting the control of body volume in the larvae of the mosquitoes Aedes aegypti and Aedes detritus. Edw. J. Exp. Boil. 54, 67-82 (1971).
