Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

פרוטוקול זיהומים Plasmodium falciparum בקביעת הפנוטיפ יתושים זיהום

Published: July 4, 2007 doi: 10.3791/222

Summary

ברגע גן מזוהה עקשן פוטנציאלי עבור מלריה, זה חייב להיות מוערך על תפקידה במניעת זיהומים Plasmodium בתוך היתוש. פרוטוקול זה מדגים כיצד מידת זיהומים Plasmodium של יתושים יכול להיות assayed. טכניקות להכנת תרבות gametocyte, האכלה קרום יתושים דם האדם, assaying titers ויראלי midgut היתושים הם הפגינו.

Abstract

ברגע גן מזוהה עקשן פוטנציאלי עבור מלריה, זה חייב להיות מוערך על תפקידה במניעת זיהומים Plasmodium בתוך היתוש. פרוטוקול זה מדגים כיצד מידת זיהומים Plasmodium של יתושים יכול להיות assayed. טכניקות להכנת תרבות gametocyte, האכלה קרום יתושים דם האדם, assaying titers ויראלי midgut היתושים הם הפגינו.

Protocol

א הכנת תרבות gametocyte:

  1. תביאו דם אדם טרי בסרום עד 37 מעלות צלסיוס בתוך אמבט מים.
  2. במנדף קטר, בתנאים סטריליים, pipet 1 מ"ל של דם חם לתוך צינור Eppendorf. ספין הדם בצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 2200 סל"ד. אריתרוציטים יש pelleted, להסיר ולסלק את הנסיוב ברור. לשטוף erythocytes עם נפח שווה של חדש 3 פעמים כדי לקבל נסיוב הדם כולו gametocytes.
  3. אחזר את התרבות gametocyte מן CO 2 באינקובטור או צנצנת נר. תרבות זו יש לשמור על RPMI התקשורת נמאס היתושים ביום 16 של התרבות. כדי לקבוע את% gametocytemia (ביום 16 של התרבות) להפוך את כתם דק בשקופית זכוכית עם דם טיפה אחת ולבצע Geimsa כתם. לקבוע את מספר הגמטות בשדה התרבות הטפיל. זה בדרך כלל בטווח של 2-4%. חשב את נפח הדם כולו כי תצטרך להשיג את הרצוי gametocytemia% הסופית (0.3 -1%).
  4. הסר ביותר של התקשורת מתרבות gametocyte שלך ​​באמצעות pipet, נזהרת שלא להפריע או למצוץ את הטפילים (פרזיטים יופיעו שחור בעוד התקשורת יהיה ורוד בהיר / אדום). Pipet את שאר כלי התקשורת וטפילים לתוך שפופרת 15 מ"ל בז. ספין בצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 2200 סל"ד. טפילים ו אריתרוציטים גלולה יהיה, להסיר ולסלק התקשורת supernatant ללא טפילים מטרידים.
  5. שלב טפילים עם נפח הדם כולו מוכן (מ A2 צעד) לתת לך את gametocytemia הסופי הרצוי על פי חישובים קודמים. Pipet לערבב היטב. (~ 1 דקה)

זהו עכשיו המדגם תוכלו להאכיל את היתושים שלך. שמור על 37 מעלות צלזיוס באמבט של מים.

ב יתושים האכלה:

  1. שים יתושים אנופלס שלך (~ 30-50) לתוך שעווה מצופה כוסות קרטון מכוסה רשת רשת מאובטחת על ידי גומייה או מכסה קרטון מסופק עם כוס. אנו משתמשים aspirator המופעל באמצעות סוללה נטענת עבור שלב זה.
  2. הכן את זרימת המים באמבט ידי הוספת חרירי משני צדי ניזונים זכוכית צינור גומי. חבר כמו ניזונים רבות ככל שאתה צריך בסדרה: קצה אחד של הסדרה צריך להיות שמחוברות בצינור circulator האמבט במים (החלק דוחף מים דרך ניזונים), את הקצה השני של הסדרה צריכה להיות מורכבת צינורות גומי שקוע באמבטיה כדי לאפשר את המים שהופץ לרוקן לתוך אמבטיה. הפעל את האמבטיה במים עד כ 37 מעלות צלסיוס ומים הוא מחזורי דרך ניזונים וחזרה לאמבטיה. זה חיוני כדי לשמור על חם הדם ולשמור פרזיטים בחיים.
  3. הכן את הממברנה (אנו משתמשים ריבועים קטנים של parafilm נמתח) על ידי מתיחת סביב מזין את הממברנה זכוכית, תוך שימוש בלחץ לאטום בחוזקה פתיחת מזין. קרום זה יהיה לחקות את העור.
  4. מקום אחד מזין קרום בצד למטה על כל כוס יתושים ניזונים מאובטח באמצעות מלחציים או קלטת. הממברנה צריך לשבת מיושר עם הרשת כך יתושים יכול לגשת אליו מבפנים הגביע.
  5. בזהירות פיפטה טפיל דם ארוחה (מ A5 צעד) לתוך צווארו של מזין, מוודא דם הולך כל הדרך דרך הצוואר אל תוך המאגר, פנייה קרום כך היתושים יכולים לגשת דם. אנו משתמשים על 200 μl של דם לכל מזין, אבל זה יכול להשתנות.
  6. אפשר להאכיל את היתושים. אנו מאפשרים להם להאכיל עבור ≈ 30 דקות (משתנה, בהתאם theexperiment, כי רוב הניסויים, לעתים ניטור כמה כבר עברו ארוחה מלהסתכל תוכן הדם בחלל הבטן).
  7. לאחר האכלה, להסיר ניזונים מן כוסות יתושים. כבה את האמבטיה במים לנתק ניזונים מן צינורות.
  8. הסר את קרום ולספוג ניזונים ב אקונומיקה 10% לטהר ולשטוף עם מים. המקום מזוהם החומר (ממברנות, מגבות נייר, כפפות, וכו ') לתוך שקית פיקדון Biohazard קטן ב קיבול Biohazard גדול.
  9. הרדימי יתושים על ידי הצבת כוסות במקרר או בחדר קר. לאחר יתושים מורדמים לגמרי, להעביר אותם על צלחת פטרי מוטבע בתוך דלי קרח. יתושים מיין, והביטה בזהירות אל הבטן לכל סימן של ארוחה הדם, וזורקים אותם כי לא להאכיל. יתושים חלקם יהיו צבה מלא בעוד שאחרים יציגו רצועה צרה של דם בלע; כל מקובלות כמו "נמאס". שים את היתושים נמאס חזרה לתוך כוסות קרטון.
  10. לספק ארוחה סוכר (פיסת צמר גפן טבול סוכרוז 10%) על יתושים, ועל דגירה בתנאים insectary נורמלי למשך 7 ימים. כל יום, היתושים יש לעקוב לשיעור התמותה. בנוסף, הכותנה צריכה להיעשות רטוב עם סוכרוז, כך שהם אינם מקופחים של מזון. זה יותר טוב, ובכל זאת, כדי להוסיף מגבת נייר ספוגה במים מזוקקים, כדי לשמור על היתושים לח. יתושים אלה פ falcipraum נגוע, כך שכל הטיפול חייב להילקח כך יתושים לא יכול escapדואר מהספל. מומלץ לשים את כוסות הגנה cagefor קטן כפול.

ג הביתור midguts יתוש והערכת המון oocyst:

  1. לשאוב יתושים (מ-B צעד) מן כוסות קרטון באמצעות aspirator המופעל באמצעות סוללה נטענת. הרדימי יתושים, אשר נמצאים בתוך המאגר aspirator נשלף, על ידי הזזת לחדר קר או לקבור את מאגר בקרח במשך לפחות 5 דקות או עד יתושים להפסיק לנוע.
  2. העברת יתושים הרדים מן המאגר אל צלחת פטרי זכוכית מוטבע קרח. מורחים את היתושים כדי בשכבה אחת ומכסים במכסה פלסטיק צלחת פטרי. יתושים כי לא ניתן לאכלס על הצלחת להישאר המאגר, אשר חזר לחדר קר או קרח.
  3. באמצעות קנס שקצהו מלקחיים, העברת יתוש אחד מצלחת עד 100 ul PBS הכלול בשקופית זכוכית רכוב תחת מיקרוסקופ לנתיחה. השאירו את השאר מכוסה בצלחת פטרי צונן.
  4. באמצעות קנס שקצהו מלקחיים, החזק יתושים בבית החזה ואת הבטן האחורי. משוך את הגוף בנפרד עד midgut חשוף. שימוש במלקחיים כדי להסיר עודפי רקמה מהבטן gut.The נראה כמו לבן, דמויי גוף. הסרת רקמה עודפת מן gut.Mount המעיים אחד טוב של שקופית 12-היטב זכוכית לטבול μl 5-10 של 0.2% יוד. סקווש נבלת וזורקים על towel.Continue נייר לחה יתושים אחרים, עד 12 שקופיות גם מלא. מכסים את האומץ רכוב עם coverslip זכוכית.
  5. בדוק אומץ תחת מיקרוסקופ אור, מחפש שביצים עגול כתם ורוד בהיר נגד רקמת ברור / חלש המעיים ורוד. הרוזן שביצים, שיא ולהמשיך מדגם הבאה. המשך לכל היתושים מכל טיפולים ניסיוניים.
  6. בסיום, למחוק שקופיות לנקות עם מגבת נייר. מניחים את מגבת נייר עם אומץ, וגם מגבת נייר עם פגרים, לשקית Biohazard קטן וזורקים לפח. כפפות שחוקים לאורך ההליך. הטיפול נלקח לא לתת כל לברוח יתושים נגועים.

Discussion

לא יכול להיות כמה וריאציות הזיהום Plasmodium לבין פנוטיפ נחישות זיהום מעבדות שונות עשוי לעקוב בטכניקות שונות.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Anopheles Animal mosquitos
Plasmodium falciparum Animal Parasite. Gametocytes with known gametocytemia.
15 mL conical tubes plastic
Serum, blood human, O+
0.2% mercurochrome
glass-slide 12 well
light microscope
cell counter
10% bleach
pipette tips for tissue culture
parafilm
mosquito feeder glass membrane feeders, rubber tubing to fit feeders
Petri dishes slass
fine-tip forceps
PBS buffer 1X, sterile
circulating water bath
pipetteman

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Avila, S. L., Ferreira, A. W. Malaria diagnosis: a review. Braz J Med Biol Res. 29 (4), 431-443 (1996).
  2. Bell, A. S., Ranford-Cartwright, L. C. A real-time PCR assay for quantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector. Int J Parasitol. 34 (7), 795-802 (2004).
  3. Collins, K. M., Hochberg, L. P., Ryan, P. R., Collins, W. E., Wirtz, R. A., Ryan, J. R. Quantification of Plasmodium malariae infection in mosquito vectors. Ann Trop Med Parasitol. 98 (5), 469-472 (2004).
  4. Czeher, C., Labbo, R., Djibrilla, A., Here, L., Arzika, I., Duchemin, J. B. ELISA study of oocyst-sporozoite transition in malaria vectors. Parasite. 13 (3), 257-261 (2006).
  5. Haghdoost, A. A., Mazhari, S., Bahadini, K. Comparing the results of light microscopy with the results of PCR method in the diagnosis of Plasmodium vivax. J Vector Borne Dis. 43 (2), 53-57 (2006).
  6. Patsoula, E., Spanakos, G., Sofianatou, D., Parara, M., Vakalis, N. C. A single-step, PCR-based method for the detection and differentiation of Plasmodium vivax. Ann Trop Med Parasitol. 97 (1), 15-21 (2003).
  7. Osta, M. A., Christophides, G. K., Kafatos, F. C. Effects of mosquito genes on Plasmodium development. Science. 303 (5666), 2030-2032 (2004).
  8. Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation. J Biol Chem. 279 (7), 5581-5587 (2004).

Tags

ביולוגיה של התא גיליון 5 יתושים מלריה גנטיקה הזרקה RNAi Plasmodium בתרבית רקמה תרבית תאים חרקים
פרוטוקול זיהומים Plasmodium falciparum בקביעת הפנוטיפ יתושים זיהום
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xi, Z., Das, S., Garver, L.,More

Xi, Z., Das, S., Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination. J. Vis. Exp. (5), e222, doi:10.3791/222 (2007).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter