Piattaforme microfabbricazione per coltura cellulare meccanicamente dinamica

Summary

In questo protocollo, dimostriamo la realizzazione di una serie di messaggi microattuatore verticalmente sfollati su cui si basa la tecnologia, e come questa tecnologia di base può essere modificato per condurre high-throughput di coltura cellulare meccanicamente dinamica sia la cultura bidimensionale e tridimensionale paradigmi.

Abstract

La capacità di sondare sistematicamente in risposta cellulare in vitro a combinazioni di stimoli mechanobiological per l'ingegneria tissutale, la scoperta di farmaci o fondamentali studi di biologia cellulare è limitata dalle tecnologie attuali bioreattore, che non può allo stesso tempo applicare una varietà di stimoli meccanici di cellule in coltura. Per affrontare questo problema, abbiamo sviluppato una serie di piattaforme di microfabbricazione progettato per schermo per gli effetti degli stimoli meccanici in un formato high-throughput. In questo protocollo, dimostriamo la realizzazione di una serie di messaggi microattuatore verticalmente sfollati su cui si basa la tecnologia, e illustra, inoltre, come questa tecnologia di base può essere modificata per condurre high-throughput di coltura cellulare dinamica meccanicamente in entrambe le due dimensioni e tre paradigmi cultura dimensionale.

Protocol

A. Descrizione del dispositivo e il funzionamento

I dispositivi sono fabbricati con multistrato litografia soft ¹ in polidimetilsilossano (PDMS), e sono in grado di generare simultaneamente una serie di condizioni meccaniche in singoli luoghi di coltura cellulare attraverso l'array microfabbricazione. In questo protocollo, i passaggi per fabbricare una vasta gamma di azionamento pneumatico-microposts sono descritta per la prima, seguita dalla procedura per modificare il dispositivo per consentire la cultura meccanicamente dinamica sia bidimensionali (2D) e tridimensionali (3D) paradigmi della cultura. L'approccio delineato microfabbricazione aumenta il throughput rispetto agli attuali sistemi di macroscala, ed è più adatto per lo screening per gli effetti di una varietà di condizioni meccaniche.

Il principio di funzionamento del dispositivo si basa su una serie di microposts verticale azionato. Microposts sono fabbricati su un diaframma liberamente sospeso, e sono sollevato e abbassato mediante l'applicazione di pressioni positive e negative sotto il diaframma di attuazione (Figura 1). Una caratteristica fondamentale della matrice è che variando la dimensione del diaframma di attuazione, una fonte di pressione singolo può essere utilizzato per ottenere una serie di spostamenti verticali attraverso l'array. Questo principio è usato per lo screening rapido risposta cellulare ad un gran numero di condizioni di stimolazione meccanica attraverso un unico dispositivo.

Sulla base di un progetto analogo macroscala da Schaffer et al. ^2, il nostro progetto prevede una seconda sospesa e lubrificati film di coltura cellulare sopra il perno, consentendo alle cellule di esperienza deformazione 2D substrato come scivola la cultura cinematografica sul post carico sollevato. In alternativa, photopatterning una serie di cellule cariche di idrogel nei messaggi di carico a compressione permette di stimolazione delle cellule in coltura 3D. Istruzioni dettagliate nella creazione di questi sistemi seguire.

B. Realizzazione della serie microattuatore pneumatico

Realizzazione della serie microattuatore pneumatico richiede l'allineamento rigorosi in strutture multistrato PDMS. Questo è difficile, a causa di errori di allineamento ritiro indotta registrazione. Per risolvere questo problema, usiamo un processo di fabbricazione chiamato 'fabbricazione stampo panino' ^3, mostrato per eliminare in modo efficace questo problema ^4.

Materiali di preparazione

1. Singola o multi-livello SU-8 maestri per ciascuno dei vari livelli sono fabbricati in una camera sterile utilizzando le procedure standard. Per questi dispositivi, i maestri sono 200-400 micron di spessore, a seconda dell'applicazione. Maestri sono hardbaked a 80 ° C per tre giorni prima dell'uso.
2. Vetrini puliti e SU-8 maestri sono silanizzata in una camera a vuoto, per evitare l'adesione di stagionatura PDMS ai materiali. In un fumehood, 60 ml di agente silanizzazione (tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-triclorosilano (United Technologies Chemical, Bristol, PA) è pipettati in una scatola Petri nella camera. Il vetro nudo e SU-8 maestri vengono inseriti nella camera e tenuta sotto vuoto durante la notte.
3. Due tamponi in schiuma (disponibile nei negozi di artigianato) e una pellicola trasparente in testa a getto d'inchiostro sono tagliati a dimensioni leggermente più grande del SU-8 master utilizzato per la fabbricazione panino stampo.

Sandwich Mold Fabrication

1. Ogni strato del dispositivo multistrato richiede uno strato PDMS stampato con questo metodo. Uno schema del processo di fabbricazione panino stampo è fornito in Figura 1.
2. PDMS monomero e reticolante sono accuratamente miscelati nello standard rapporto 10:1. 3 mL di miscela non polimerizzato PDMS sono depositati su un fabbricato già SU-8 master, e degasato in una camera a vuoto.
3. Il pad in schiuma e SU-8 master sono collocato su una piastra di base in plexiglass.
4. La trasparenza è attentamente abbassato sul polimerizzato PDMS, avendo cura di evitare di intrappolare eventuali bolle d'aria. Lucidi a getto d'inchiostro hanno una ruvida e un lato liscio, ed è importante che i contatti lato liscio del PDMS non polimerizzate.
5. Un vetrino silanizzata è posto sulla cima della trasparenza, sotto il pad in schiuma seconda e una piastra superiore in plexiglass. Il panino viene poi bloccato insieme usando un C-morsetto.
6. Il panino PDMS è curato in forno a 80 ° C per almeno 4 ore.
7. Il panino viene rimosso dal forno e lasciare raffreddare prima di togliere la fascetta.
8. Il morsetto viene rimosso e il panino smontato, e le spugne vengono scartati. La trasparenza viene accuratamente staccato dal SU-8 master, mantenendo il film di fantasia PDMS.
9. Questi strati PDMS a motivi geometrici e loro livelli di trasparenza di gestione possono essere memorizzati in un ambiente privo di polvere fino a quando non sono pronti per l'uso. Abbiamo utilizzato con successo strati PDMS fino a due mesi, senza effetti evidenti deleteri.

Costruire il dispositivo multistrato

t "> Lo schema per la fabbricazione del vettore microattuatore è fornita nella Figura 2A, e il funzionamento degli attuatori è mostrato nelle Figure 2 B e C. Per fabbricare il dispositivo:

1. La più bassa fantasia PDMS strato è preparato da costruzione a sandwich stampo. Per questi esperimenti, modelli circolari che vanno da 600 a 1200μm di diametro sono stati utilizzati.
2. Lo strato PDMS è poi trasferito in un vetrino pulito. Una unità di effetto corona è usato per trattare le superfici PDMS e vetro con plasma di ossigeno, e le due superfici sono posti in contatto tra loro. Lo stack viene poi collocato su una piastra a 80 ° C per completare il processo di incollaggio. La trasparenza può essere staccato e scartati. Durante questo processo, il film modellato PDMS non viene rilasciato da un substrato rigido, impedendo restringimento dei singoli strati.
3. A seconda del successo della fase di stampaggio a sandwich, film sottili di PDMS che non sono stati schiacciati dalla tra il SU-8 caratteristiche e la trasparenza può avere bisogno di essere rimosso. Questo può essere fatto manualmente utilizzando un ago 25G sotto uno stereoscopio.
4. Lo strato panino secondo stampata si forma come stampo replica negativa del diaframma desiderato-e post-struttura. Questo perché fabbricazione di grandi superfici SU-8 maestri è impegnativo, ma l'uso di processi di fabbricazione alternativa potrebbe eliminare questo ulteriore passaggio. In questa dimostrazione, circolare messaggi 500 micron di diametro sono stati utilizzati. Lo stampo replica negativa è silanizzata, e temporaneamente, apposto su un vetrino con del nastro biadesivo. Polimerizzato PDMS si deposita, degassata e spin-rivestito su questo strato panino stampo per 45 secondi a 1000 giri, ottenendo un diaframma di attuazione 60 micron di spessore. Lo spin-rivestito strato PDMS è parzialmente cured a 80 ° C per circa 20 minuti, o fino a quando il PDMS è appiccicoso, ma non si deforma in modo permanente quando viene toccato.
5. La slitta di vetro e nastro biadesivo vengono rimossi dal parzialmente curato PDMS strato, che viene poi trattata al plasma, capovolta e posta in una misura allineatore. L'allineatore è costituito da un mandrino vuoto montato un micromanipolatore (Siskiyou; Missione Viego, CA, USA). Il primo strato PDMS è poi plasma curati e posti su un palco rotante (Newmark, Grants Pass, OR, USA), sotto il mandrino vuoto, e l'allineamento tra i due strati si osserva con uno zoom 12x Navitar sistema di visione artificiale (Navitar; Rochester, NY, USA).
6. Gli strati sono allineati con il manipolatore, e accuratamente messi in contatto. Il panino viene poi rimosso dalla allineatore, e curato in forno a 80 ° C per altri 30 minuti. La trasparenza e silanizzate replica stampo PDMS può essere sbucciata dal dispositivo e scartati. Il dispositivo è poi completamente guarito a 80 ° C per almeno quattro ore.
7. A seconda del tipo di esperimento condotto stimolazione meccanica, ulteriori strati PDMS può essere legato a questo dispositivo di base ripetendo il processo delineato. Dettagli per i vari tipi di esperimenti di stimolazione meccanica sono forniti nelle sezioni C e D.

Connettori

1. Una volta che il dispositivo è completato, un ago può essere utilizzato per eliminare lo strato PDMS al punto di connessione.
2. Connettori commerciali come il Nanoport (Upchurch scientifico; Oak Harbor, WA, USA) può essere utilizzato per interfacciarsi con tubi esterni. Al fine di evitare prescrizioni sull'altezza di connettori commerciali, e quindi uso standard piastre Petri come contenitori dispositivo, noi costruiamo la nostra come segue.
3. Circa 35 g di PDMS è lanciato e curato in una omni-bene vassoio (Nunc, Rochester, NY, USA). Il dispositivo è sbucciata e tagliata in sezioni piccola guarnizione, da cui un 1 / 8 "foro viene rimosso con un pugno.
4. Un ago da 18G smussati viene usato per nucleo una sezione dal lato della guarnizione. Un ago più piccolo 21G è usato per rimuovere il nucleo centrale prima di estrarre l'ago 18G.
5. Circa 15g di PDMS è lanciato e curato in una omni-bene coperchio del vassoio, sbucciate e tagliate a sezione di dimensioni simili. Questa sezione è poi pulito con lo scotch, plasma legato alla parte superiore della guarnizione, e l'unità di plasma è legato al dispositivo, lato pugni verso il basso.
6. Un secondo ago smussato 18G è quindi separato dal connettore luer plastica colorata, inserito nel foro torsolo e sigillate sul posto con qualche goccia di PDMS. Il connettore che ne risulta è abbastanza efficace, economico ed ha un volume di spazio morto abbastanza grandi da evitare bolle d'aria entrino i canali di liquido durante le fasi di riempimento.

C. meccanicamente attivo substrati cultura 2D

L'array di microposts azionamento può essere utilizzato per creare diversi profili di tensione in un film polimerico in sospensione, sulla quale vengono coltivate le cellule. Alzare la posta in un film lubrificato fa il film di scivolare e deformare tutto il post. Utilizzando una circolare risultati messaggio di carico in una distribuzione ceppo equibiaxial, ma ildesign è versatile in quanto forme altro posto può essere usato per creare una varietà di campi di deformazione. Per modificare l'array attuatore per esperimenti di coltura 2D (schema nella figura 3):

1. Legame un terzo strato PDMS al dispositivo, come mostrato nella Figura 3a. Il terzo strato PDMS è costituito da una struttura a due livelli. Il cerchio inferiore corrisponde alla dimensione della cavità attuazione sotto il microposts azionato. Il diametro del cerchio superiore è 100μm superiore al diametro dei posti di carico. A 200 micron microcanali gamma collega queste caratteristiche ad una zona di collegamento, e sarà usato per lubrificare i post di carico e cultura cinematografica.
2. Realizzare e connettori legame al dispositivo, come descritto in precedenza.
3. Cappotto Spin a 10-15 micron strato spesso di PDMS sulla parte liscia di una trasparenza (parametri di rotazione: 4000 RPM, 120 secondi). Polimerizzazione a 80 ° C per almeno 4 ore.
4. Appy a basso livello di vuoto (Barnant pompa di aspirazione Air Cadet) agli attuatori, abbassando la serie di post.
5. Plasma trattare e il legame pellicole di rotazione PDMS al Microdevice azionato. Mettere su una piastra a 80 ° C per 10 minuti. I pali e la cultura cinematografica rimarrà idrofilo per un breve periodo.
6. Riempire i canali di lubrificazione con glicerolo 90% in soluzione di acqua deionizzata. Oltre alla lubrificazione, questa formulazione mantiene l'idrofilia del PDMS a tempo indeterminato, riducendo i coefficienti di attrito. Bolle d'aria restano intrappolate tra il post e cultura cinematografica. Posizionare il dispositivo su una piastra a 40 ° C, e continuano a iniettare lubrificante nel canale, causando un piccolo aumento di pressione. Dopo pochi minuti, le bolle d'aria si diffonderà attraverso il PDMS, e tutte le superfici saranno lubrificate.
7. Rimuovere la pressione negativa, rilasciando il post.
8. Usando un bisturi, tagliare tutto il film sottile PDMS. Con attenzione sbucciare la trasparenza supporto dal dispositivo.
9. Plasma bond a mano taglio PDMS guarnizione intorno alla zona della cultura del dispositivo.
10. Sterilizzare il dispositivo di immersione in etanolo al 70% per 5 minuti, e poi sotto una luce UV germicida in una cappa di sicurezza biologica per 45 minuti.
11. Plasma trattare la superficie e incubare con 100 mg / ml di collagene (o alternativa di proteine ​​ECM) durante la notte a 4 ° C.
12. Lavare il dispositivo con tampone fosfato (PBS), e le cellule semi a 10-15.000 cellule / cm ^2, a seguito di protocolli standard di coltura cellulare.

Caratterizzazione dettagliata del funzionamento microdispositivi e gli esperimenti biologici condotti su questa piattaforma sono stati pubblicati altrove ^7.

D. idrogel 3D meccanico attivo

Le modifiche al dispositivo può anche essere usato per abilitare la compressione di photopatterned. cell-carico, tridimensionale idrogel in un high-throughput modo. In questo esempio, abbiamo creato 350 micron di diametro in polietilene glicole (PEG) cilindri idrogel, incapsulando C3H10T1 / 2 cellule staminali mesenchimali del mouse, e applicare tensioni di compressione da 5 a 25% attraverso l'array. Questo protocollo può essere utilizzato con idrogel chimiche più avanzate fotopolimerizzazione. Per utilizzare la piattaforma per gli esperimenti in tridimensionale mechanobiology (schema in Figura 4):

Dispositivo modifiche:

1. Rivestire il post con uno strato di 1 micron di spessore di parylene-C per ridurre la permeabilità ai gas e migliorare i tempi di polimerizzazione del sistema idrogel PEG. Ciò consentirà di ridurre gli effetti citotossici del radicale libero a base di reazione di fotopolimerizzazione. Pezzi di nastro adesivo sono utilizzati per mascherare le aree intorno al post, e il dispositivo è rivestito in un PDS 2010 LabCoter impianto a 2 (Sistemi di rivestimento speciali, Indianapolis, IN, USA).
2. Il dispositivo ricoperto viene rimosso dal sistema di rivestimento, e il nastro adesivo staccato, lasciando uno strato conformazionale di parylene-C sopra i pali.
3. Un coprioggetto di vetro è methacrylated ⁸ per immersione in un 2% v / v soluzione di 3 - (trimetossisilil) metacrilato propil in etanolo al 95% per 2 minuti.
4. Il coprioggetto è risciacquato in 100% di etanolo, e cotto al forno a 100 ° C, lasciando i gruppi metacrilato sulla superficie.
5. Un film spesso 200 micron distanziatore PDMS è lanciato in una capsula di Petri, e tagliata in piccole sezioni. Quattro di queste sezioni sono piccoli plasma legato intorno al bordo del vetrino methacrylated.
6. I distanziali sono poi plasma aderenti al-aree PDMS del dispositivo, che copre il parylene-C messaggi rivestito.
7. Il dispositivo è sterilizzato con il lavaggio in etanolo al 70%, e l'esposizione a luce UV germicida in una cappa di sicurezza biologica per 45 minuti.

Polimerizzazione in situ:

Cell-carichi di idrogel PEG sono state poi modellate photolithographically nei dispositivi ^8,9 come segue:

1. Preparare al 10% w / v PEGDA (3.4kDa, Laysan Bio, arabo, AL, USA) e il 10% w / v PEG (8kDa, Sigma-Aldrich)soluzione in unsupplmented mezzi di coltura cellulare.
2. Preparare una soluzione madre fotoiniziatore di 100 mg / mL di Irgacure 2959 (Ciba Specialty Chemicals, Tarrytown, NY, USA) nel 1-vinil-2-pyrolidinone.
3. Mescolare le due soluzioni preparate insieme per ottenere una soluzione con una concentrazione di 0,4% w / v di fotoiniziatore. Filtrare la miscela attraverso un filtro da 0,45 micron siringa per sterilizzare e rimuovere il particolato.
4. Trypsinize colture cellulari e preparare una sospensione di cellule in terreni di coltura, al doppio del desiderato punto finale la concentrazione cellulare.
5. Mescolare la sospensione cellulare e il filtrato idrogel precursore / fotoiniziatore soluzione in un rapporto di 1:1.
6. Iniettare la soluzione nel microdispositivi mediante un lungo ago 25G. Accuratamente evitare di intrappolare bolle nel dispositivo.
7. Allineare una maschera di trasparenza stampato a segni di allineamento sulla superficie del dispositivo. Istituire un sistema di illuminazione UV per fornire una dose UV di 17,5 mW / cm ² sulla superficie del dispositivo. Illuminare l'idrogel attraverso la maschera per 195 s. Questa volta è stato ottimizzato per il nostro sistema, e potrebbe essere necessario un aggiustamento.
8. Lavare via non polimerizzato soluzione precursore idrogel con PBS, e sostituire il PBS con terreni di coltura. Azionare i post di carico per comprimere i costrutti idrogel.

Caratterizzazione dettagliata del funzionamento microdispositivi e gli esperimenti biologici condotti su questa piattaforma sono stati pubblicati altrove ^10.

E. apparecchiature periferiche

Modificato piastre di Petri vengono utilizzati per mantenere la sterilità di colture di cellule in fase di avviamento dei dispositivi. Un ago smussato e spogliato 18G è incollato con resina epossidica in un foro praticato nel lato della capsula di Petri. Tubi (Clay Adams Intramedic PE190; VWR International, Arlington Heights, IL, USA) è a pressione montate questi connettori e si collega al elettrovalvole controllata e fonte di pressione.

Pressioni per i dispositivi sono forniti da micropompe esterni. Per gli esperimenti 2D, i valori di pressione positiva 30-55 kPa sono stati generati utilizzando una tensione controllata eccentrica pompa a diaframma (SP 500 CE-LC 4.5VDC; Schwarzer Precision, Germania). Un impulso a larghezza di controllo della tensione di modulazione basata viene usato per variare la tensione applicata al controllo della pressione di uscita. Elettrovalvole e collettori (S10MM-30-12-3 e MSV10-1; Pneumadyne, Plymouth, MN, USA) sono utilizzate per creare una forma d'onda ciclica di pressione. Le valvole sono azionate con un segnale a 12 V, controllato da un generatore di piazza funzione d'onda.

F. caratterizzazione del dispositivo e l'uso

Imaging sul dispositivo

Un problema comune con le cellule o particelle di imaging sul dispositivo è scarsa risoluzione ottica a causa della condensazione di gocce sotto la pellicola PDMS sostenere il post carico. Questa condensazione deriva da differenze di temperatura e umidità all'interno dell'incubatrice e dopo la fissazione o su un palcoscenico microscopio. Per risolvere questo problema:

1. Collegare un serbatoio aperto alla porta di ingresso della pressione, e riempirlo con acqua deionizzata. Noi usiamo una siringa aperto con un connettore luer lock per convenienza.
2. Posizionare il dispositivo e serbatoio riempito in una camera a vuoto, e pompa giù.
3. Aspettare 5 minuti, e portare la camera a pressione atmosferica. Ripetere due o tre volte. Quando l'aria è spostato fuori dei canali del dispositivo, esso viene sostituito con l'acqua del serbatoio, eliminando i condensati goccia e fornendo un percorso chiaro per la microscopia ottica.
4. Aree culturali immagine utilizzando in campo chiaro o microscopia a fluorescenza.

Per l'imaging cellulare dal vivo, questa procedura può essere fatta prima di seminare le cellule sui dispositivi. Tuttavia, i canali devono essere progettati abbastanza grande da prevenire eventuali perdite di viscosa di pressione tra le unità del dispositivo.

Caratterizzazione del ceppo di monitoraggio tallone

Sui sistemi 2D cultura:

1. Diluire 1 perline fluorescenti micron di diametro (Bangs Laboratories, Fisher, IN) in metanolo alla concentrazione desiderata. Diluizioni di 1:150 dalle concentrazioni originali (1% di solidi in soluzione tampone tallone) sono risultati essere adatto alle nostre esigenze.
2. Plasma trattare la superficie del dispositivo e deposito 5-10 microlitri di sospensione tallone.
3. Attendere che il metanolo ad evaporare. Ripetere se la concentrazione tallone è troppo bassa.
4. Immagine della cellula aree culturali a riposo e sotto carico.
5. Open-source automatizzato algoritmi di tracciamento di particelle può essere utilizzato in ImageJ (NIH) per monitorare spostamenti tallone.
6. Parametri di grandezza spostamento, la direzione e la posizione può essere quindi utilizzato in un modello matematico per caratterizzare campi di deformazione sulla superficie del dispositivo.

Una procedura simile può essere seguita per caratterizzare i ceppi nei sistemi 3D. Miscelare una quantità di perline fluorescenti nel hydrogel precursore soluzione. Nel caso del sistema di idrogel PEG, le dimensioni dei pori sono molto più piccoli rispetto a quelli delle perle 1 micron di diametro. Perle sono incapsulati in idrogel, e il sistema può essere ripreso con un microscopio confocale. Spostamenti cordone possono essere monitorati, analizzati e montato su un modello di deformazione.

G. Rappresentante Risultati

Risultati rappresentativi per la fabbricazione del dispositivo, la caratterizzazione e il funzionamento sono previste nelle figure 5 e 6.

Figura 1. Stampo processo Sandwich fabbricazione. (A) Una maggiore trasparenza in testa è attentamente abbassata sul polimerizzato PDMS su un SU-8 master. (B) Il sandwich è posto in una pila schiuma, vetro e metallo, e curato in un forno a compressione. (C) La pila è smontato e la trasparenza staccato, mantenendo la fantasia PDMS layer ^3. Riprodotto con il permesso dell'Istituto di Fisica.

Figura 2. Schematica di micropost verticale azionato a (A) riposo e (B) quando viene azionato. (C) Schema del processo di fabbricazione multistrato necessario per creare un array di microposts ^3. Adattato con il permesso dell'Istituto di Fisica.

Figura 3. Processo di modificare microattuatore serie di condurre esperimenti di cellule coltivate su una deformazione bidimensionale substrato ^7. Riprodotto con il permesso della Royal Society of Chemistry http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .

Figura 4. Processo di modificare microattuatore serie di condurre esperimenti di cellule in coltura in tre dimensioni idrogel photopatterned costruisce ^10. Riprodotto con il permesso di Elsevier.

Figura 5. (A) Esempio di dispositivo per la cultura mechanostimulatory 2D. Colorante rosso usato per marcare la azionamento canali di distribuzione della pressione, e colorante blu utilizzato per contrassegnare i canali di lubrificazione. (B) l'immagine del campione di un esperimento di caratterizzazione del ceppo. Macchie rosse rappresentano la posizione deformata delle perle, mentre le macchie verdi rappresentano le posizioni deformate ^7. Riprodotto con il permesso della Royal Society of Chemistry http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .

Figura 6. (A) Esempio di dispositivo per il 3D esperimenti di compressione. Verde colorante usato per marcare canali di pressione attuazione. (B) Top-down vista di array micropost con (C) un idrogel costruire modellata in cima al post. (D, E) Side-ricostruite le immagini di perline fluorescenti in idrogel costruire sotto (D) e riposo (E) la pressione di azionamento 55 kPa, a dimostrazione del processo di caratterizzazione del ceppo in un sistema di coltura 3D ^10. Riprodotto con il permesso di Elsevier.

Discussion

Anche se concettualmente semplice, fabbricazione del dispositivo ci vuole una certa abilità sperimentale e pratica. In particolare nel caso di colture cellulari in 2D, l'allineamento degli strati multipli nel dispositivo può essere impegnativo, soprattutto in una grande area array. In pratica, possiamo ottenere un affidabile al 100% tasso di successo allineamento utilizzando dispositivi con 50 micron di tolleranza nella spaziatura tra le funzioni adiacenti in strati multipli. Abbiamo anche dimostrato con successo l'allineamento con tolleranze più basso di 15 micron, ma il tempo di allineamento richiesto è notevolmente maggiore ed è ottenuta ad un tasso di successo inferiore. L'allineamento della maschera di biomateriali photopattern sul array è altrettanto impegnativo, ma i post può essere progettato per essere molto grande rispetto ai cilindri idrogel, per alleviare questo vincolo.

Altre sfide riguardano la coltura cellulare su materiali descritti in questo protocollo. Nel sistema 2D stretching, utilizzando PDMS come un film cultura limiti indagine biologica a breve termine esperimenti, come l'adesione delle cellule al substrato comincia a essere sostanzialmente toccati dopo 6 ore di stimolazione. Questo può essere corretta con proteine ​​della matrice legame covalente alla superficie PDMS ¹¹ o sostituendo il substrato cellulare PDMS cultura con un materiale in poliuretano più clinicamente rilevanti, per migliorare l'adesione delle cellule e offrire una maggiore flessibilità nel condotto esperimenti biologici ^12. Nel sistema 3D descritto, la chimica idrogel è inteso come un esempio illustrativo. A lungo termine cultura di cellule aderenti richiede l'uso di idrogel alternativa naturale o sintetica, oppure l'inclusione di ligandi nella matrice PEG (che può essere facilmente realizzato utilizzando chimiche PEGilazione di serie) ^13.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 PDMS Monomer and Crosslinker Kit	Dow Corning
SU-8 masters
Silanization agent: (tridecafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane	United Chemical Technologies
Foam pads			Craft supply stores, 1-2 mm thick
Overhead inkjet transparencies	Grand Toy
Plexiglass plates
C-clamp			hardware store
Micromanipulator system	Siskiyou, Inc.
Custom-made vaccum mount
Vision system, Navitar 12x zoom	Navitar
Connecting tubes	VWR international	Clay Adam Intramedic PE190
Blunt 18G needles	Small Parts (www.smallparts.com)
Eccentric diaphragm micropump	Schwarzer Precision	SP 500 EC-LC4.5V DC
Solenoid valves	Pneumadyne	S10MM-30-12-3
Solenoid manifold	Pneumadyne	MSV10-1
Function generator
3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate	Sigma-Aldrich
Polyethylene glycol diacrylate 3.4 kDa	Laysan Bio Inc.
Polyethylene glycol 8 kDa	Sigma-Aldrich
Irgacure 2959	Ciba Specialty Chemicals
1-vinyl-2-pyrolidinone	Sigma-Aldrich
Standard cell culture reagents