Summary
In dit protocol, tonen we de fabricage van een Microactuator reeks van verticaal verschoven berichten op de technologie gebaseerd is, en hoe deze basistechnologie kunnen worden gewijzigd om high-throughput mechanisch dynamische celkweek te voeren in zowel twee-dimensionale en drie-dimensionale cultuur paradigma's.
Abstract
De mogelijkheid om systematisch onderzoek in vitro cellulaire respons op combinaties van mechanobiological stimuli voor tissue engineering, drug discovery of fundamentele celbiologie studies wordt beperkt door de huidige bioreactor technologieën, die niet tegelijkertijd van toepassing zijn een verscheidenheid aan mechanische stimuli aan gekweekte cellen. Om dit probleem aan te pakken, hebben we een serie van microfabricated platforms ontwikkeld om de effecten van mechanische stimuli scherm in een high-throughput formaat. In dit protocol, tonen we de fabricage van een Microactuator reeks van verticaal verschoven berichten op de technologie gebaseerd is, en verder aan te tonen hoe deze basistechnologie kunnen worden gewijzigd om high-throughput mechanisch dynamische celkweek te voeren in zowel twee-dimensionale en drie- dimensionale cultuur paradigma's.
Protocol
A. Device beschrijving en werking
Apparaten worden vervaardigd met behulp van meerlaagse soft lithografie 1 in polydimethylsiloxaan (PDMS), en zijn in staat van gelijktijdige opwekking van een scala van mechanische omstandigheden in individuele cel cultuur locaties in het hele microfabricated array. In dit protocol zijn de stappen om een reeks van pneumatisch aangedreven-micropalen fabriceren voor het eerst beschreven, gevolgd door stappen om het apparaat te wijzigen om mechanisch dynamische cultuur in staat stellen in zowel twee-dimensionale (2D) en drie-dimensionale (3D) cultuur paradigma's. De geschetste microfabricated aanpak verhoogt de doorvoersnelheid over bestaande macroschaal systemen, en is het meest geschikt voor de screening van de effecten van een verscheidenheid aan mechanische omstandigheden.
De operationele principe voor het apparaat is gebaseerd op een reeks van verticaal bediend micropalen. Micropalen worden gefabriceerd op een vrij opgehangen membraan, en zijn omhoog en omlaag door het toepassen van positieve en negatieve druk onder de aandrijving membraan (figuur 1). Een belangrijk kenmerk van de array is dat door het variëren van de grootte van de aandrijving middenrif, een enkele druk bron kan worden gebruikt om een reeks van verticale verplaatsingen binnen de array te verkrijgen. Dit principe wordt gebruikt om snel het scherm cellulaire respons op een groot aantal mechanische stimulerende omstandigheden in een enkel apparaat.
Op basis van een analoog macroschaal ontwerp van Schaffer et al.. Twee, ons ontwerp is voorzien van een seconde onderbroken en gesmeerd celcultuur film over de post, waardoor cellen om 2D-substraat vervorming als de cultuur film bevestiging over het verhoogde belasting post experience. Als alternatief, photopatterning een reeks van cel-beladen hydrogelen over de laad-berichten zorgt voor compressie stimulatie van cellen in 3D-cultuur. Gedetailleerde instructies bij het opzetten van deze systemen te volgen.
B. Fabricage van de pneumatische Microactuator reeks
Fabriceren van de pneumatische Microactuator reeks vereist strenge aanpassing in multilayer PDMS structuren. Dit is uitdagend, als gevolg van krimp-geïnduceerde alignment registratie fouten. Om dit maken we gebruik van een fabricageproces genoemd 'sandwich mal fabricage' 3, aangetoond dat het effectief elimineren dit probleem 4.
Materialen Voorbereiding
- Single-of multi-level SU-8 masters voor elk van de verschillende niveaus zijn gefabriceerd in een cleanroom met behulp van standaard procedures. Voor deze apparaten, meesters 200-400 micrometer dik, afhankelijk van de toepassing. Meesters zijn hardbaked bij 80 ° C gedurende drie dagen voorafgaand aan gebruik.
- Schoon glas dia's en de SU-8 masters zijn gesilaniseerd in een vacuümkamer, om de hechting van het genezen van PDMS aan de materialen te voorkomen. In een fumehood, is 60 pi van de silanisatie agent (tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichloorsilaan (United Chemical Technologies, Bristol, PA) gepipetteerd in een petrischaaltje in de kamer. De kale glas en SU-8 masters worden geplaatst in de kamer en hield onder vacuüm 's nachts.
- Twee foam pads (verkrijgbaar bij de ambachtelijke aanbod winkels) en een overhead inkjet transparanten worden gesneden en maten iets groter is dan de SU-8 meester gebruikt voor sandwich schimmel fabricage.
Sandwich Mold Fabrication
- Elke laag van de meerlaagse apparaat vereist een PDMS laag gegoten met behulp van deze methode. Een schema van de sandwich mal fabricageproces is gegeven in figuur 1.
- PDMS monomeer en verharder worden grondig gemengd in de standaard 10:01-verhouding. 3 ml van niet uitgeharde PDMS mengsel zijn afgezet op een eerder gefabriceerd SU-8 meester, en ontgast in een vacuümkamer.
- Het schuim pad en SU-8 meester worden geplaatst op een plexiglas bodemplaat.
- De transparantie wordt zorgvuldig neergelaten op de uitgeharde PDMS, zorg ervoor om te voorkomen dat vangen van eventuele luchtbellen. Inkjet transparanten hebben een ruwe en een gladde kant, en het is belangrijk dat de gladde kant contact op met de niet uitgeharde PDMS.
- Een gesilaniseerd glasplaatje wordt geplaatst op de top van de transparantie, onder de tweede schuimrubber en een plexiglas bovenplaat. De sandwich is dan samen geklemd met behulp van een C-klem.
- De PDMS sandwich is uitgehard in een oven op 80 ° C gedurende ten minste vier uur.
- De sandwich wordt verwijderd uit de oven en laten afkoelen voordat u de klem.
- De klem wordt verwijderd en de sandwich gedemonteerd, en het schuim pads worden verwijderd. De transparantie wordt zorgvuldig geschild weg van de SU-8 meester, met behoud van de patroon PDMS film.
- Deze patronen PDMS lagen en de behandeling van transparantie van lagen kunnen vervolgens worden opgeslagen in een stofvrije omgeving tot ze klaar zijn voor gebruik. We hebben met succes gebruikt PDMS lagen tot twee maanden oud, met geen merkbare schadelijke effecten.
De bouw van de multilayer-apparaat
t "> Het schema voor de productie van de Microactuator array is gegeven in figuur 2A, en de werking van de actuatoren is te zien in de figuren 2B en C. Om het apparaat te fabriceren:- De onderste patroon PDMS-laag wordt bereid door sandwich schimmel fabricage. Voor deze experimenten werden cirkelvormige patronen, variërend van 600 tot 1200μm in diameter worden gebruikt.
- De PDMS-laag wordt dan overgebracht naar een schoon glasplaatje. Een corona-ontlading-eenheid wordt gebruikt om de PDMS en glazen oppervlakken met zuurstof plasma te behandelen, en de twee oppervlakken in contact gebracht met elkaar. De stapel wordt dan geplaatst op een kookplaat bij 80 ° C om de hechting te voltooien. De transparantie kan dan worden afgepeld en weggegooid. Tijdens dit proces, is het patroon PDMS film nooit vrijgelaten uit een rigide ondergrond, het voorkomen van krimp van de afzonderlijke lagen.
- Afhankelijk van het succes van de sandwich moulding stap, dunne films van PDMS die niet zijn uit geperst uit tussen de SU-8 functies en de transparantie kan het nodig zijn worden verwijderd. Dit kan gedaan worden handmatig met een 25G naald onder een stereoscoop.
- De tweede sandwich gevormde laag is gevormd als een negatieve mal replica van het gewenste diafragma-en post-structuur. Dit komt omdat de fabricage van grote oppervlakte SU-8 masters is een uitdaging, maar het gebruik van alternatieve fabricageprocessen kunnen elimineren deze extra stap. In deze demonstratie werden ronde berichten 500 micrometer in diameter worden gebruikt. De negatieve replica mal is gesilaniseerd, en tijdelijk aangebracht op een glasplaatje met dubbelzijdig tape. Niet uitgeharde PDMS is gedeponeerd, ontgast en spin-coating op dit broodje mal laag gedurende 45 seconden bij 1000 RPM, waardoor een bediening diafragma 60 micrometer dik. De spin-coating PDMS laag is gedeeltelijk uitgehard bij 80 ° C gedurende ~ 20 minuten, of totdat de PDMS kleverig is, maar niet blijvend vervormt bij aanraking.
- De glazen schuif-en dubbelzijdige tape zijn verwijderd van de gedeeltelijk uitgeharde PDMS-laag, die vervolgens wordt plasma-behandeld, omgekeerd en geplaatst in een custom-made aligner. De aligner bestaat uit een vacuüm klauwplaat gemonteerd op een micromanipulator (Siskiyou, Mission Viego, CA, USA). De eerste PDMS laag is dan plasma-behandeld en geplaatst op een roterende fase (Newmark, Grants Pass, OR, USA), onder het vacuüm boorkop, en afstemming tussen de twee lagen wordt waargenomen met behulp van een Navitar 12x zoom machine vision systeem (Navitar; Rochester, NY, USA).
- De lagen zijn afgestemd op het gebruik van de manipulator, en zorgvuldig in contact gebracht. De sandwich wordt vervolgens verwijderd uit de aligner, en genezen in een oven op 80 ° C nog 30 minuten. De transparantie en gesilaniseerd replica PDMS mal kan dan worden gepeld uit het apparaat en weggegooid. Het toestel is dan volledig uitgehard bij 80 ° C gedurende ten minste vier uur.
- Afhankelijk van het type van de mechanische stimulatie experiment wordt uitgevoerd, kunnen extra PDMS lagen dan worden gebonden aan deze basis het apparaat door het herhalen van de geschetste proces. Details voor de verschillende soorten mechanische stimulatie experimenten zijn te vinden in de secties C en D.
Connectors
- Zodra het apparaat is voltooid, kan een naald worden gebruikt om de PDMS laag duidelijk op het punt van de verbinding.
- Commerciële connectors zoals de Nanoport (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA, USA) kan vervolgens worden gebruikt om te communiceren met externe slang. Om te voorkomen dat de hoogte-eisen van commerciële connectoren, en daardoor standaard petrischaaltjes te gebruiken als het apparaat containers, we fabriceren onze eigen als volgt.
- Ongeveer 35 g van de PDMS is gegoten en uitgehard in een omni-well tray (Nunc, Rochester, NY, USA). Het apparaat is geschild en gesneden in kleine pakking secties, van waaruit een 1 / 8 "hole is verwijderd met behulp van een punch.
- Een 18G botte naald wordt gebruikt om de kern uit een sectie van de kant van de pakking. Een kleinere 21G naald wordt gebruikt om de centrale kern te verwijderen voordat intrekking van de 18G naald.
- Ongeveer 15 g van de PDMS is gegoten en uitgehard in een omni-well tray deksel, geschild en gesneden in vergelijkbare grootte sectie. Dit gedeelte wordt vervolgens gereinigd met plakband, plasma-gebonden naar de top van de pakking, en het apparaat is plasma gebonden aan het apparaat, sloeg naar beneden.
- Een tweede stompe 18G naald wordt vervolgens gescheiden van de gekleurde plastic luer connector, ingebracht in de gevulde gat en verzegeld in plaats met een paar druppels van PDMS. De resulterende connector is zeer effectief, zuinig en heeft een dode ruimte volume groot genoeg zijn om luchtbellen te voorkomen dat het invoeren van de kanalen tijdens de vloeistof vullen stadia.
C. Mechanisch actief 2D-cultuur substraten
De array van bediende micropalen kan worden gebruikt om verschillende stam profielen in een zwevende polymeer film, op welke cellen worden gekweekt. Het verhogen van de post in een gesmeerde film zorgt ervoor dat de film uit te glijden en vervormen rond de post. Met behulp van een ronde laden functie resulteert in een equibiaxial stam distributie, maar hetdesign is veelzijdig in dat verschillende functie vormen kunnen worden gebruikt om een verscheidenheid van stam velden te creëren. Als u de aandrijving array voor 2D-cultuur experimenten (schematisch in figuur 3):
- Bond derde PDMS laag om het apparaat, zoals weergegeven in figuur 3a. De derde PDMS laag bestaat uit een twee laags structuur. De onderste cirkel komt overeen met de grootte van de bediening holte onder de in werking gestelde micropalen. De diameter van de bovenste cirkel is 100 urn groter is dan de diameter van de laad-berichten. Een 200 micrometer breed microkanaal verbindt deze kenmerken om een verbinding gebied, en zal worden gebruikt om de laad-functies en de cultuur film smeren.
- Fabriceren en obligaties connectors aan het apparaat, zoals eerder beschreven.
- Spin jas een 10-15 um dikke laag van PDMS op de gladde kant van een transparant (spin parameters: 4000 RPM, 120 seconden). Cure bij 80 ° C gedurende ten minste vier uur.
- Appy een low-level vacuüm (Barnant Air Cadet aspiratie pompen) tot de actuatoren, het verlagen van de array van de berichten.
- Plasma behandelen en bond de spin coating PDMS film aan de in werking gestelde microdevice. Plaats op een kookplaat bij 80 ° C gedurende 10 minuten. De palen en cultuur film zal hydrofiele blijven gedurende een korte tijd.
- Vul de smering kanalen met een 90% glycerol in gedeïoniseerd water oplossing. In aanvulling op smeren, deze formulering houdt de hydrofiliciteit van het PDMS voor onbepaalde tijd, waardoor de wrijving coëfficiënten. Luchtbellen blijft gevangen tussen de post en de cultuur film. Plaats het apparaat op een kookplaat bij 40 ° C, en blijven smeermiddel injecteren in het kanaal, waardoor een kleine druk te verhogen. Na een paar minuten, zal de luchtbellen diffunderen door de PDMS, en alle oppervlakken worden gesmeerd.
- Verwijder de negatieve druk, het loslaten van de berichten.
- Met behulp van een scalpel, snij je rond de dunne PDMS film. Zorgvuldig verwijderen van de transparantie steun uit de buurt van het apparaat.
- Plasma bond een met de hand gesneden PDMS pakking rond het apparaat cultuur gebied.
- Steriliseer het apparaat door het weken in 70% ethanol gedurende 5 minuten, en vervolgens onder een kiemdodende UV-licht in een biologisch veiligheidskabinet gedurende 45 minuten.
- Plasma behandelen oppervlak en incubeer met 100 ug / ml collageen (of een alternatieve ECM eiwitten) overnacht bij 4 ° C.
- Was het apparaat met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), en het zaad cellen op 10-15000 cellen / cm 2, volgens standaard celkweek protocollen.
Gedetailleerde karakterisering van microdevice werking en biologische experimenten uitgevoerd op dit platform zijn elders 7 gepubliceerd.
D. Mechanisch actieve 3D-hydrogels
Wijzigingen in het apparaat kan ook worden gebruikt om de compressie van photopatterned mogelijk te maken. cel-beladen, drie-dimensionale hydrogels in een high-throughput wijze. In dit voorbeeld maken we 350 micrometer diameter van polyethyleenglycol (PEG) hydrogel cilinders, inkapselen C3H10T1 / 2 muis mesenchymale stamcellen, en toe te passen druk-stammen, variërend van 5 tot 25% over de hele array. Dit protocol kan gebruikt worden met meer geavanceerde hydrogel fotopolymerisatie chemie. Om het platform te gebruiken voor experimenten in drie-dimensionale Mechanobiologie (schematisch in figuur 4):
Het apparaat wijzigingen:
- De vacht van de berichten met een 1 micrometer dikke laag parylene-C van gas permeabiliteit te verminderen en de polymerisatie tijden in de PEG hydrogel-systeem. Dit zal de cytotoxische effecten van de vrije radicalen op basis van fotopolymerisatie reactie. Stukken van Scotch tape worden gebruikt om de gebieden masker rond de paal, en het apparaat is bedekt met een PDS 2010 LabCoter 2-systeem (Specialty Coating Systems, Indianapolis, IN, USA).
- De gecoate apparaat is verwijderd uit het coating systeem, en het plakband afgepeld, waardoor er een conforme laag van parylene-C over de berichten.
- Een glazen dekglaasje wordt methacrylated 8 door onderdompeling in een 2% v / v oplossing van 3 - (trimethoxysilyl) propyl methacrylaat in 95% ethanol gedurende 2 minuten.
- Het dekglaasje wordt gespoeld in 100% ethanol, en gebakken bij 100 ° C, waardoor methacrylaatgroepen op het oppervlak.
- Een 200 um dikke PDMS spacer film is gegoten in een petrischaal en snijd ze in kleine stukken. Vier van deze kleine secties zijn plasma gebonden aan de rand van de methacrylated dekglaasje aan.
- De afstandhouders worden dan plasma gebonden aan de PDMS-gebieden van het apparaat, over de parylene-C coating berichten.
- Apparaat is gesteriliseerd door het wassen in 70% ethanol, en blootstelling aan kiemdodend UV licht in een biologisch veiligheidskabinet gedurende 45 minuten.
In situ polymerisatie:
Cell-beladen PEG hydrogelen werden vervolgens photolithographically patroon in de apparaten 8,9 als volgt:
- Bereid een 10% w / v PEGDA (3.4kDa, Laysan Bio, Arabische, AL, USA) en 10% w / v PEG (8kDa, Sigma-Aldrich)oplossing in unsupplmented celcultuur media.
- Maak een foto-initiator voorraad oplossing van 100 mg / ml Irgacure 2959 (Ciba Specialty Chemicals, Tarrytown, NY, USA) in 1-vinyl-2-pyrolidinone.
- Grondig mengen de twee voorbereide oplossingen om een oplossing te verkrijgen met een concentratie van 0,4% m / v van de foto-initiator. Filtreer het mengsel door een 0,45 pm spuitfilter te steriliseren en te verwijderen deeltjes.
- Trypsinize celculturen en bereiden een celsuspensie in cultuur media, twee keer het gewenste eindpunt cel concentratie.
- Meng de celsuspensie en de gefilterde hydrogel precursor / fotoinitiator oplossing in een verhouding van 1:1.
- Injecteer de oplossing in de microdevice met behulp van een lange 25G naald. Zorg ervoor, trapping bubbels in het apparaat.
- Lijn een gedrukte transparant masker om uitlijntekens op het apparaat oppervlak. Opzetten van een UV-belichting systeem om een UV-dosis van 17,5 mW / cm 2 te bieden op het apparaat oppervlakte. Verlichten de hydrogel door het masker voor 195 s. Deze keer is geoptimaliseerd voor ons systeem, en moet mogelijk worden aangepast.
- Afwassen niet-gepolymeriseerde hydrogel precursor-oplossing met PBS, en vervang de PBS met cultuur media. Bedien de belasting berichten de hydrogel constructies te comprimeren.
Gedetailleerde karakterisering van microdevice werking en biologische experimenten uitgevoerd op dit platform zijn gepubliceerd elders 10.
E. Randapparatuur
Gewijzigd petri gerechten worden gebruikt om de steriliteit van celculturen te behouden tijdens bediening van de apparaten. Een afgestompte en gestript 18G naald is geëpoxeerd in een gat geboord in de zijkant van de petrischaal. Slangen (Clay Adams Intramedic PE190, VWR International, Arlington Heights, IL, USA) is druk gemonteerd om deze connectoren en maakt verbinding met de gecontroleerde magneetventielen en druk de bron.
De druk om de apparaten worden geleverd door externe micropompen. Voor het 2D-experimenten werden positieve druk waarden 30 tot 55 kPa gegenereerd met behulp van een voltage-gecontroleerde excentrische membraanpomp (SP 500 EG-LC 4.5VDC, Schwarzer Precision, Duitsland). Een pulse-width modulation op basis van voltage-controller wordt gebruikt om het toegepaste voltage te variëren druk output control. Magneetventielen en manifolds (S10MM-30-12-3 en MSV10-1; Pneumadyne, Plymouth, MN, USA) worden gebruikt om een cyclische druk golfvorm te creëren. De kleppen worden bediend met een 12 V-signaal, bestuurd door een blokgolf functie generator.
F. Device karakterisatie en het gebruik
Beeldvorming op het apparaat
Een gemeenschappelijk probleem met beeldvorming cellen of deeltjes op het apparaat is slecht optische resolutie door de condensatie van druppels onder de PDMS film ter ondersteuning van de laad-post. Deze condensatie komt voort uit verschillen in temperatuur en luchtvochtigheid in de couveuse en na fixatie of op een microscoop podium. U kunt dit probleem:
- Sluit een open reservoir om de druk inlaatpoort, en vul het met gedemineraliseerd water. We maken gebruik van een open spuit met een luer-lock aansluiting voor het gemak.
- Plaats het apparaat en gevuld reservoir in een vacuümkamer, en de pomp naar beneden.
- Wacht 5 minuten en breng de kamer tot de atmosferische druk. Herhaal dit twee of drie keer. Als de lucht wordt verplaatst buiten de kanalen van het apparaat, wordt deze vervangen met water uit het reservoir, waardoor de druppel condensaten en het verstrekken van een duidelijke optische pad voor microscopie.
- Beeldcultuur gebieden met behulp van helder veld of fluorescentie microscopie.
Voor live cell imaging, kan deze procedure worden gedaan voordat het zaaien van de cellen op de apparaten. Er moet echter kanalen worden ontworpen groot genoeg om een viskeuze verliezen van druk te voorkomen tussen eenheden op het apparaat.
Stamkarakterisatie door kraal tracking
Op de 2D cultuur systemen:
- Verdun 1 micrometer diameter van TL-kralen (Bangs Laboratories, Fisher, IN) in methanol om de gewenste concentratie. Verdunningen van 1:150 van de oorspronkelijke concentratie (1% vaste stoffen in kraal bufferoplossing) bleken geschikt te zijn voor onze behoeften.
- Plasma behandelen van het apparaat oppervlak, en storten 50-10 pi kraal schorsing.
- Wacht tot de methanol om te verdampen. Herhaal indien kraal concentratie is te laag.
- Het imago van de celcultuur gebieden in rust en onder belasting.
- Open-source geautomatiseerde deeltje tracking algoritmes kunnen vervolgens worden gebruikt in ImageJ (NIH) tot hiel verplaatsingen te volgen.
- Verplaatsing grootte, richting en locatie parameters kunnen vervolgens worden gebruikt in een wiskundig model om spanning velden karakteriseren op het apparaat oppervlak.
Een soortgelijke procedure kan worden gevolgd om stammen te karakteriseren in 3D-systemen. Meng een hoeveelheid fluorescerende kralen in de hydrogel precursor-oplossing. In het geval van de PEG hydrogel-systeem, de porie maten zijn veel kleiner dan die van de 1 micrometer diameter van kralen. Kralen worden ingekapseld in de hydrogel, en het systeem kan worden afgebeeld met behulp van een confocale microscoop. Kraal verplaatsingen kunnen dan worden gevolgd, geanalyseerd en gemonteerd op een vervorming model.
G. representatieve resultaten
Representatieve resultaten voor apparaat fabricage, karakterisering en de werking worden gegeven in Figuren 5 en 6.
Figuur 1. Sandwich schimmel fabricageproces. (A) Een overhead transparantie wordt zorgvuldig neergelaten op niet uitgeharde PDMS op een SU-8 master. (B) De sandwich is geplaatst in een schuim, glas en metaal stack, en genezen in een oven onder druk. (C) De stack is gedemonteerd en de transparantie afgepeld, met behoud van het patroon PDMS laag 3. Gereproduceerd door toestemming van het Institute of Physics.
Figuur 2. Schematische voorstelling van verticaal aangedreven micropost bij (A) rust en (B) wanneer geactiveerd. (C) Schematische voorstelling van meerlagige fabricage proces nodig is om een reeks van micropalen 3 te maken. Aangepast met toestemming van het Institute of Physics.
Figuur 3. Process tot Microactuator scala wijzigen om experimenten uit te voeren voor de cellen gekweekt op een vervormende twee-dimensionale substraat zeven. Gereproduceerd door toestemming van de Royal Society of Chemistry http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .
Figuur 4. Proces te Microactuator scala wijzigen om experimenten uit te voeren voor de cellen gekweekt in een driedimensionale photopatterned hydrogel constructies 10. Overgenomen met toestemming van Elsevier.
Figuur 5. (A) Sample-apparaat voor 2D mechanostimulatory cultuur. Rode kleurstof gebruikt om de druk bedienen van distributiekanalen, en de blauwe kleurstof gebruikt om de smering kanalen Mark Mark. (B) Sample image van een stam karakterisering experiment. Rode vlekken vertegenwoordigen de onvervormde locatie van de kralen, terwijl de groene plekken vertegenwoordigen de vervormde locaties 7. Gereproduceerd door toestemming van de Royal Society of Chemistry http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .
Figuur 6. (A) Sample-apparaat voor 3D-compressie experimenten. Groene kleurstof gebruikt om de bediening onder druk kanalen markeren. (B) Top-down view van micropost array (C) een hydrogel bouwen patroon op de top van de paal. (D, E) Side-gereconstrueerde beelden van fluorescerende kralen in de hydrogel construct onder (D) rust en (E) 55 kPa bediening druk, het aantonen van de stam karakterisering in een 3D-cultuur systeem 10. Overgenomen met toestemming van Elsevier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel conceptueel eenvoudig, het apparaat fabricage vergt wel wat experimentele vaardigheid en oefening. Vooral in het geval van een 2D-celkweek, kan uitlijning van de meerdere lagen in het apparaat een uitdaging zijn, vooral over een grote oppervlakte array. Praktisch gezien kunnen we betrouwbaar bereiken van een 100% afstemming succes gebruik van apparaten met 50 urn van tolerantie in de ruimte tussen aangrenzende functies in meerdere lagen. We hebben ook met succes aangetoond afstemming met toleranties zo laag als 15 pm, maar de gewenste uitlijning tijd is aanzienlijk groter en is bereikt bij een lagere kans op succes. Uitlijning van het masker te photopattern biomaterialen op de array is eveneens een uitdaging, maar de palen kunnen worden ontworpen om heel groot zijn in vergelijking met de hydrogel cilinders, het verlichten van deze beperking.
Andere uitdagingen betrekken celcultuur op de materialen beschreven in dit protocol. In de 2D-spansysteem, met behulp van PDMS als een cultuur van film beperkt biologisch onderzoek op korte termijn experimenten, zoals cel hechting aan de ondergrond begint te ingrijpende gevolgen zullen hebben na 6 uur van de stimulatie. Dit kan worden verholpen door het covalent binden matrix eiwitten aan het oppervlak 11 PDMS, of door vervanging van de PDMS celkweek substraat met een meer klinisch relevante polyurethaan materiaal, naar cel adhesie te verbeteren en zorgen voor meer flexibiliteit in de uitgevoerde biologische experimenten 12. In de beschreven 3D-systeem, is de hydrogel chemie bedoeld als een illustratief voorbeeld alleen. Op lange termijn de cultuur van hechtende cellen vereist het gebruik van alternatieve natuurlijke of synthetische hydrogels, of het opnemen van adhesieve liganden in de PEG-matrix (die gemakkelijk kan worden bereikt met behulp van standaard PEGylering chemicaliën) 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij erkennen de financiële steun van het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada en de Canadese Institutes of Health Research (CHRPJ 323533-06), de Ontario Graduate Scholarship programma CM, en de Canada Onderzoek Stoelen in Micro en Nano Engineering Systems aan YS, en in Mechanobiology naar CAS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 PDMS Monomer and Crosslinker Kit | Dow Corning | ||
| SU-8 masters | |||
| Silanization agent: (tridecafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | United Chemical Technologies | ||
| Foam pads | Craft supply stores, 1-2 mm thick | ||
| Overhead inkjet transparencies | Grand Toy | ||
| Plexiglass plates | |||
| C-clamp | hardware store | ||
| Micromanipulator system | Siskiyou, Inc. | ||
| Custom-made vaccum mount | |||
| Vision system, Navitar 12x zoom | Navitar | ||
| Connecting tubes | VWR international | Clay Adam Intramedic PE190 | |
| Blunt 18G needles | Small Parts (www.smallparts.com) | ||
| Eccentric diaphragm micropump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | |
| Solenoid valves | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Function generator | |||
| 3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | ||
| Polyethylene glycol diacrylate 3.4 kDa | Laysan Bio Inc. | ||
| Polyethylene glycol 8 kDa | Sigma-Aldrich | ||
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | ||
| 1-vinyl-2-pyrolidinone | Sigma-Aldrich | ||
| Standard cell culture reagents |
References
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Schaffer, J. L. Device for the application of a dynamic biaxially uniform and isotropic strain to a flexible cell culture membrane. J Orthop Res. 12, 709-719 (1994).
- Jo, B., Lerberghe, L. V. an, Motsegood, K., Beebe, D. Three-dimensional micro-channel fabrication in polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer. Journal of Microelectromechanical Systems. 9, 76-81 (2000).
- Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Solving the shrinkage-induced PDMS alignment registration issue in multilayer soft lithography. J. Micromech. Microeng. 19, 065015-065015 (2009).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Bongaerts, J., Fourtouni, K., Stokes, J. Soft-tribology: Lubrication in compliant PDMS-PDMS contact. Tribology International. 40, 1531-1542 (2007).
- Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a chip. 10, 227-234 (2010).
- Liu, V. A., Bhatia, S. N. Three-dimensional photopatterning of hydrogels containing living cells. Biomedical Microdevices. 4, 257-266 (2002).
- Hahn, M. S. Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels. Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31, 577-584 (2010).
- Wipff, P. J. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30, 1781-1789 (2009).
- Moraes, C. Integrating polyurethane culture substrates into poly(dimethylsiloxane) microdevices. Biomaterials. 30, 5241-5250 (2009).
- Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue engineering. 13, 2369-2385 (2007).
