Summary
이 프로토콜에서는, 우리는 기술의 기반이되는 수직 전이 게시물의 마이크로 액추에이터 어레이의 제조 방법 및이 기본 기술이 모두 2 차원 입체 문화에 높은 처리량 기계 역동적인 세포 배양을 실시하도록 수정할 수 있습니다을 증명 패러다임.
Abstract
조직 공학, 약물 발견이나 기본적인 세포 생물학 연구를위한 mechanobiological 자극의 조합을 체외 세포 반응에 체계적으로 조사하는 기능은 동시에 교양 세포에 기계적 자극의 다양한 적용할 수없는 현재의 생물 반응기 기술에 의해 제한됩니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 높은 처리량 형식의 기계적 자극의 효과에 대한 화면으로 설계된 microfabricated 플랫폼 시리즈를 개발하였습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 기술을 기반으로, 나아가 이러한 기본 기술이 2 차원과 모두에서 높은 처리량 기계 역동적인 세포 배양을 실시하기 위해 수정할 수있는 방법을 보여줍니다되는 수직 전이 게시물의 마이크로 액추에이터 어레이의 제조 보여줍 세 - 차원 문화 패러다임.
Protocol
A. 장치 설명 및 작업
장치는 polydimethylsiloxane (PDMS)의 다층 소프트 리소그래피 1을 사용 조작하고, 동시에 microfabricated 배열에 걸쳐 각각의 세포 배양 장소에 기계 조건의 범위를 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 pneumatically - actuated microposts의 배열을 조작하는 단계가 먼저 모두 2 차원 (2D) 및 입체 (3D) 문화 패러다임의 기계적 역동적인 문화를 활성화하기 위해 장치를 수정하는 단계로 다음, 설명되어 있습니다. 설명 microfabricated 접근 방식은 기존 시스템에 비해 처리량 macroscale 증가 시키며, 최고의 다양한 기계적 조건의 영향에 대한 심사에 적합합니다.
장치의 작동 원리는 수직으로 actuated microposts의 배열을 기반으로합니다. Microposts은 자유롭게 - 정지 피임기구를 가공하고 있으며, 사육 및 작동 다이어프램 (그림 1) 아래에 긍정적이고 부정적인 압력을 적용하여 저하됩니다. 배열의 핵심 기능은 작동 다이어프램의 크기를 변화하여 단일 압력 소스가 배열에 걸쳐 수직 변위의 범위를 얻기 위해 사용될 수있다는 것입니다. 이 원리는 급속하게 단일 장치를 통해 기계 stimulatory 조건의 다수 세포 응답을 화면으로 사용됩니다.
샤퍼 외하여 유사한 macroscale 디자인 2. 기반으로 우리의 디자인은 세포가 제기 로딩 게시물을 통해 문화 영화 풀렸는데 같은 2D 기판 변형을 경험할 수 있도록 게시를 통해 두 번째 정지 및 윤활 세포 배양 필름을 포함하고 있습니다. 또는 로딩 게시물을 통해 셀 - 라덴 hydrogels의 photopatterning 배열 3D 문화에 세포의 압축 자극을 허용합니다. 이러한 시스템 설정에 대한 자세한 지침은 다음과 같습니다.
공압 마이크로 액추에이터 배열의 B. 제작
공압 마이크로 액추에이터 어레이를 Fabricating 것은 다층 PDMS 구조의 엄격한 정렬이 필요합니다. 이것은 도전적인 수축 유발 정렬 등록 오류로 인해 발생합니다. 이것을 해결하기 위해, 우리는 효과적으로이 문제에게 4 제거 표시 '샌드위치 금형 제조'3 칭했다 제조 공정을 사용합니다.
재료 준비
- 다양한 수준의 각각에 대해 단일 또는 다중 레벨 SU - 8 주인은 표준 절차를 사용하여 청정실에서 가공하고 있습니다. 이러한 장치의 경우, 석사는 응용 프로그램에 따라, 200-400 μm의 두께입니다. 석사는 사용 ° 사흘 동안 C 이전 80 hardbaked 있습니다.
- 깨끗한 유리 슬라이드와 SU - 8 주인은 자료 PDMS 치료의 접착을 방지하기 위해, 진공 챔버에 silanized 있습니다. fumehood에서 silanization 에이전트 60 μL (tridecafluoro - 1 ,1,2,2 - tetrahydrooctyl) - 1 - trichlorosilane는 (미국 화학 기술, 브리스톨, PA) 챔버에 페트리 접시에 pipetted입니다. 맨 유리와 SU - 8 주인은 챔버에 배치하고 야간 진공 아래에 보관됩니다.
- 두 발포 패드 (공예 공급 상점에서 사용할 수 있음) 및 오버헤드 잉크젯 투명 필름 샌드위치 금형 제조에 사용되는 SU - 8 마스터보다 약간 큰 크기로 절단됩니다.
샌드위치 몰드 제작
- 다층 장치의 각 계층이 방법을 사용하여 성형 PDMS 레이어가 필요합니다. 샌드위치 금형 제조 공정의 구조도는 그림 1에서 제공됩니다.
- PDMS 단량체와 crosslinker는 철저하게 표준 10시 1분 비율 혼합됩니다. uncured PDMS 혼합물 3 ML은 이전에 가공 SU - 8 마스터에 예치하고, 진공 챔버에 degassed 있습니다.
- 발포 패드 및 SU - 8 마스터는 플렉시 글라스베이스 플레이트에 위치하고 있습니다.
- 투명성은 신중하게 어떤 공기 방울을 트래핑하지 않아야하고, uncured PDMS로 저하됩니다. 잉크젯 투명는 거칠고 부드러운 측면을 가지고 있고 그것 부드러운 측면 연락처 uncured PDMS 중요합니다.
- silanized 유리 슬라이드는 두 번째 폼 패드와 플렉시 글라스 톱 판 아래, 투명성의 상단에 위치합니다. 샌드위치는 다음 C - 클램프를 사용하여 서로 고정되어있다.
- PDMS 샌드위치는 80 ° C 최소한 4 시간 동안 오븐에 완치됩니다.
- 샌드위치는 오븐에서 제거하고 클램프를 제거하기 전에 냉각 허용됩니다.
- 클램프를 제거하고 샌드위치 해체하고, 거품 패드가 버립니다됩니다. 투명성은 신중하게 패턴 PDMS 필름을 유지, SU - 8 마스터 떨어져 벗겨 있습니다.
- 그들이 사용할 준비가 될 때까지 이러한 패턴 PDMS 레이어 및 처리 투명 레이어는 다음 먼지없는 환경에 저장할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 노 눈에 해로운 효과 두 개월에 PDMS 레이어를 사용하고 있습니다.
다층 장치를 구축
t는 "마이크로 액추에이터 어레이의 제조에 대한> 개략도는 그림 2A에서 제공되고 액츄에이터의 작동은 장치를 조작하는 그림 2B와 C로 표시됩니다 :- 최저의 패턴 PDMS 레이어는 샌드위치 금형 가공에 의해 준비가되어 있습니다. 이러한 실험의 경우, 직경 600 1200μm에 이르기까지 원형 패턴이 사용되었습니다.
- PDMS 층은 다음 깨끗한 유리 슬라이드로 전송됩니다. 코로나 방전 장치는 산소 플라즈마와 PDMS와 유리 표면을 치료하는 데 사용되며, 두 개의 표면이 서로 접촉에 배치됩니다. 스택은 다음 80 열판에 위치 ° C의 결합 과정을 완료합니다. 투명도 그런 다음 멀리 벗겨 및 삭제할 수 있습니다. 이 과정에서, 패턴 PDMS 필름은 각각의 레이어의 수축을 방지, 단단한 기판에서 공개되지 않습니다.
- 샌드위치 성형 단계, SU - 8 기능과 투명성 사이에서 압박이되지 않았 PDMS의 박막의 성공에 따라하면 제거 할 수 있습니다. 이것은 수동으로 입체경 아래 25G 바늘을 사용하여 수행할 수 있습니다.
- 두 번째 샌드위치 성형 레이어는 원하는 횡경막과 - 포스트 구조의 부정적인 복제 주형으로 형성됩니다. 대형 지역 SU - 8 주인의 제조는 도전이기 때문입니다하지만, 대체 제조 공정의 사용이 추가 단계를 제거할 수 있습니다. 이 예제에서는 직경 원형 게시물 500 μm의 사용되었습니다. 부정 복제 금형은 silanized하고, 일시적으로 양면 테이프를 사용하여 유리 슬라이드에 부착된입니다. Uncured PDMS는 예금 degassed 60 μm의 두께 작동의 다이어프램을 항복, 1000 RPM에서 45 초 동안이 샌드위치 금형 계층에 스핀 - 코팅입니다. 스핀 - 코팅 PDMS 계층이 80에서 부분적으로 - 치유됩니다 ° PDMS가 끈적하지만 만졌을 때 영구적으로 변형하지 않는 C ~ 20 분, 또는 때까지.
- 유리 슬라이드를 두 번 양면 테이프는 다음 플라즈마 처리 반전 및 사용자 정의 - 만든 aligner에 배치됩니다 부분적으로 - 치료 PDMS 레이어에서 제거됩니다. aligner은 micromanipulator (; 미션 Viego, CA, 미국 시스키유)에 장착된 진공 척으로 구성되어 있습니다. 첫 번째 PDMS 계층은 진공 척 아래 (뉴 마크, 보조금 패스, OR, 미국) 플라즈마 처리와 로타리 무대에서 배치 후이며, 두 레이어 사이의 정렬은 Navitar 12 배 줌 머신 비전 시스템 (Navitar을 사용하여 관찰되며 로체스터, NY, 미국).
- 레이어는 조작하는 사람을 사용하여 정렬하고, 신중하게 접촉으로 이동됩니다. 샌드위치는 다음 aligner에서 제거하고, 추가 30 분 동안 80 ° C에서 오븐에 완치됩니다. 투명성과 silanized 복제 PDMS 금형은 다음 장치에서 벗겨 및 삭제할 수 있습니다. 장치는 다음 완벽하게 80 ° C 적어도 네 시간 동안 치료합니다.
- 기계적 자극 실험이 실시되는 종류에 따라 추가 PDMS 레이어는 다음 설명 과정을 반복하여이 기본 장치로 보세 수 있습니다. 기계적 자극 실험의 다양한 유형에 대한 세부 사항은 섹션 C와 D.에서 제공하는
커넥터
- 장치가 완료되면, 주사 바늘을 연결 지점에서 PDMS 계층을 취소하는 데 사용할 수 있습니다.
- 같은 Nanoport (업처치 과학, 오크 하버, WA, 미국)와 같은 상용 커넥터는 다음 외부 튜브와 인터페이스하는 데 사용할 수 있습니다. 상업 커넥터의 높이 요구 사항을 방지하고, 따라서 장치 용기 같은 표준 배양 접시를 사용하여, 우리는 다음과 같이 우리 자신을 조작.
- PDMS 약 35g는 (; 로체스터, NY, 미국 Nunc) 옴니 - 그럼 트레이에 주조 및 치료입니다. 장치가 벗겨, 작은 개스킷 부분으로 잘라, 어떤에서 1 / 8 "구멍 펀치를 사용하여 제거입니다.
- 18G 무딘 바늘은 코어 밖으로 근육의 측면에서 섹션을하는 데 사용됩니다. 작은 21G 바늘은 18G 바늘을 철수하기 전에 중앙 코어를 제거하는 데 사용됩니다.
- PDMS 약 15g은 주조 및 치료 옴니 - 그럼 트레이 덮개에서 벗겨 비슷하게 크기 섹션으로 절단됩니다. 이 섹션은 다음 스카치 테이프로 청소 개스킷의 상단에 플라즈마 - 보세 및 장치 펀치 측면 아래로, 장치에 플라즈마 - 보세입니다.
- 두 번째 무딘 18G 주사 바늘을 다음 색 플라스틱 luer 커넥터에서 분리 장착할 구멍에 삽입하여 PDMS의 몇 방울과 장소에 밀폐 있습니다. 결과 커넥터 경제, 매우 효과적이며, 액체 충진 단계 동안 채널 입력에서 공기 방울을 방지하기 위해 충분히 큰 죽은 공간 볼륨이 있습니다.
C. 기계 활성 2D 문화 기판
actuated microposts의 배열은 세포가 양식되는에 정지 폴리머 필름에 다양한 변형 프로필을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 윤활 필름으로 게시물을 높이면 게시물 주변 실수 변형 필름을 발생합니다. equibiaxial 스트레인 분포의 원형 로딩 게시 결과를 사용하지만,디자인 그 다른 게시물 모양에 다양한있다는 스트레인 다양한 분야를 작성하는 데 사용할 수 있습니다. 2D 문화 실험 (그림 3의 회로도)의 액추에이터 어레이를 수정하려면 :
- 본드 장치에 삼분의 일 PDMS 레이어는 같은 그림 3A에서 표시됩니다. 세 번째 PDMS 계층은 두 계층 구조로 구성되어 있습니다. 낮은 원은 actuated microposts 아래 작동의 구멍의 크기를 일치합니다. 어퍼 서클의 직경 로딩 게시물의 직경 100μm보다 큽니다. 200 μm의 다양한 microchannel는 연결 영역에 이러한 기능을 연결하고, 로딩 게시물과 문화 필름에 기름칠을하는 데 사용됩니다.
- 조작 및 장치에 본드 커넥터로 이전에 설명했다.
- 투명성의 부드러운쪽으로 PDMS의 스핀 코팅은 10-15 μm의 두꺼운 층 (스핀 매개 변수 : 4000 RPM, 120 초). 최소한 4 시간 동안 80 ° C에서 큐어.
- 게시물의 배열을 낮추는 액츄에이터에 Appy 낮은 수준의 진공 (Barnant 에어 카뎃 흡인 펌프).
- 플라즈마 처리와 결합 actuated microdevice에 스핀 코팅 PDMS 필름. 80 열판에 플레이스 ° C 10 분. 게시물과 문화 영화는 짧은 시간 동안 친수성 유지됩니다.
- 탈이온수 솔루션의 90 % 글리세롤과 윤활 채널을 입력합니다. 윤활 이외에,이 제제는 마찰 계수를 감소 무기한 PDMS의 친수성을 유지한다. 기포는 게시물과 문화 필름 사이에 갇혀 유지됩니다. 40 ° C에서 열판에 장치를 삽입하고, 작은 압력 증가의 원인, 채널에 윤활유를 주입하기 위해 계속합니다. 몇 분 후, 공기 방울은 PDMS를 통해 확산되며, 모든 표면은 윤활 것입니다.
- 게시물을 발표, 부정적인 압력을 제거합니다.
- 메스를 사용하여 얇은 PDMS 필름 주변 컷. 조심스럽게 멀리 장치에서 백업 투명도 껍질.
- 플라즈마 결합 장치 문화 주변 손으로 절단 PDMS 개스킷.
- 45 분 동안 생물 학적 안전 캐비닛에 살균 UV 라이트 아래에 다음 5 분 70 % 에탄올에 몸을 담글 수 있으며하여 장치를 소독.
- 플라즈마는 하룻밤 사이에 4 100 μg / ML 콜라겐 (또는 대체 ECM 단백질)와 표면 품어 ° C. 치료
- 칼륨이 염분 (PBS), 표준 세포 배양 프로토콜 다음 10-15000 세포 / cm 2 씨앗 세포를 버퍼로 장치를 씻으십시오.
이 플랫폼에서 실시 microdevice 운영 및 생물 학적 실험의 상세한 특성이 다른 7 공개되었습니다.
D. 기계식 활성화 차원 hydrogels
장치에 대한 수정도 photopatterned의 압축을 활성화하는 데 사용할 수 있습니다. 높은 처리량 방식으로 셀 - 라덴, 3 차원 hydrogels. 이 예제에서, 우리는 C3H10T1 / 2 마우스 mesenchymal 줄기 세포를 캡슐, 350 μm의 직경 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 히드로겔 실린더를 생성하고, 5 배열에 걸쳐 25 %까지 압축 변종을 적용합니다. 이 프로토콜은보다 고급 히드로겔 photopolymerization의 화학 같이 사용할 수 있습니다. 입체 mechanobiology (그림 4 도식)의 실험을위한 플랫폼을 사용하려면 :
장치 변경 :
- 가스 투과성을 줄이고 PEG의 히드로겔 시스템에서 중합 시간을 개선하기 위해 Parylene - C의 1 μm의 두꺼운 레이어와 문장 게시물을. 이것은 자유 라디칼 기반 photopolymerization 반응의 세포 독성 효과를 줄일 수 있습니다. 스카치 테이프의 조각이 게시물 주변의 영역을 마스크하는 데 사용되며, 장치 (특수 코팅 시스템, 인디애나 폴리스, 인디애나, 미국) PDS 2,010 LabCoter 2 시스템에 코팅됩니다.
- 코팅 장치는 코팅 시스템에서 제거하고, 스카치 테이프는 게시물을 통해 Parylene - C의 등각 계층을 떠나 멀리 벗겨 있습니다.
- (trimethoxysilyl) 프로필 메타 크릴 레이트 2 분 동안 95 %의 에탄올에 - 유리 coverslip 3의 2 % V / V 솔루션에 침수에 의해 8 methacrylated입니다.
- coverslip 100 %의 에탄올에 씻어서, 100에서 구운됩니다 ° C, 표면에 메타 크릴 레이트 그룹을 떠나.
- 200 μm의 두께 PDMS 스페이서 필름은 배양 접시에있는 주조하고, 작은 부분으로 절단됩니다. 이러한 작은 섹션 4 명이 methacrylated coverslip의 가장자리 주위에 보세 플라즈마 있습니다.
- 스페이서는 다음 플라즈마 Parylene - C 코팅 게시물을 덮고있는 장치의 PDMS - 지역에 접착됩니다.
- 장치는 70 % 에탄올로 세척하고, 45 분 동안 생물 학적 안전 캐비닛에 살균 자외선에 노출에 의해 살균됩니다.
원위치 중합의 경우 :
셀 - 라덴의 PEG hydrogels 그런 다음 photolithographically 다음과 같이 장치를 8,9로 패턴되었습니다
- 와 10 % W / V PEG (8kDa, 시그마 - 알드리치), 10 % W / V PEGDA을 (아랍, AL, 미국 3.4kDa, 레이즌 바이오) 준비unsupplmented 세포 배양 매체 솔루션입니다.
- 1 - 비닐 -2 - pyrolidinone에서, 100 Irgacure 2959 (태리, NY, 미국 시바 스페셜티 케미칼)의 MG / ML의 photoinitiator 주식 솔루션을 준비합니다.
- 철저하게 0.4 % photoinitiator의 W / V의 농도와 솔루션을 얻기 위해 함께 두 준비된 솔루션을 섞는다. 입자를 검사하고 제거하는 0.45 μm의 주사기 필터를 통해 혼합물을 필터링합니다.
- 셀 문화를 Trypsinize 두 번 원하는 엔드 포인트 세포 농도에서, 문화, 매체에 세포 현탁액을 준비합니다.
- 1:1 비율의 세포 현탁액 및 필터링 히드로겔 전구체 / photoinitiator 솔루션을 섞는다.
- 긴 25G 바늘을 사용하여 microdevice에 솔루션을 주사. 조심스럽게 장치 거품 트래핑하지 마십시오.
- 장치 표면에 정렬 마크에 인쇄된 투명 마스크를 정렬합니다. 장치의 표면에 17.5 MW / cm 2의 자외선 복용을 제공하기 위해 자외선 조명 시스템을 설정합니다. 195 S.에 대한 마스크를 통해 히드로겔을 캐는 이 시간은 우리의 시스템에 최적화된, 그리고 조정해야 할 수 있습니다.
- PBS로 멀리 unpolymerized 히드로겔 전구체 용액을 세척하고, 문화 매체와 PBS를 교체하십시오. 히드로겔 구조를 압축하기 위해 로딩 게시물을 행동시키다.
microdevice 작업이 플랫폼에서 실시한 생물 학적 실험의 상세한 특성이 다른 10 출판되었습니다.
E. 주변 기기
수정 배양 접시는 장치의 작동 중에 세포 문화의 불임을 유지하는 데 사용됩니다. 무딘 및 벗겨지고 18G 주사 바늘을 페트리 접시의 측면에서 뚫고 구멍으로 epoxied입니다. 튜빙은 (클레이 애덤스 Intramedic PE190, VWR 인터내셔널, 알링턴 헤이츠, IL, 미국)이 커넥터에 눌러 - 장착되어 있으며, 제어 솔레노이드 밸브 및 압력 소스에 연결됩니다.
장치에 압력이 외부 micropumps에 의해 제공됩니다. 2D 실험을 위해, 30-55 kPa에서 긍정적인 압력 값은 전압 제어 편심 다이어프램 펌프를 (; 슈와저 정밀, 독일, SP 500 EC - LC 4.5VDC)를 사용하여 생성되었습니다. 펄스 폭 변조 기반의 전압 컨트롤러는 압력 출력을 제어하기 위해 적용되는 전압을 다양하는 데 사용됩니다. 솔레노이드 밸브와 manifolds (S10MM - 30 - 12 - 3 MSV10 - 1, Pneumadyne, 플리 머스, 미네소타, 미국)은 순환 압력 파형을 만드는 데 사용됩니다. 밸브는 사각형 파형 함수 발생기에 의해 제어되는 12 V 신호와 actuated 있습니다.
F. 장치 특성화 및 사용
장치에 이미징
장치에 이미지 세포 또는 입자로 일반적인 문제는 로딩 게시물을 지원하는 PDMS 필름 아래 방울의 응축으로 인해 가난한 광학 해상도입니다. 이 응축은 인큐베이터 내부 온도 및 습도 차이로부터 고정 후 또는 현미경의 무대에서 발생합니다. 이 문제를 해결하려면 :
- 압력 입구 포트에 열려있는 저수지를 연결하고, 탈이온수로 채우십시오. 우리는 편의를 위해 luer 잠금 커넥터 오픈 주사기를 사용합니다.
- 진공 챔버에있는 장치와 가득한 저수지 장소, 아래로 펌프.
- 5 분 잠깐 만요,하고 대기 압력 챔버를 가지고. 두 세 번 반복합니다. 공기가 장치의 채널을 밖으로 전이되면서, 그것은 작은 물방울의 condensates를 제거하고 현미경에 대한 명확한 광학 경로를 제공, 저수지의 물로 바뀝니다.
- 명시야 또는 형광 현미경을 사용하여 이미지 문화 공간을 갖추고 있습니다.
라이브 셀 이미징의 경우,이 절차는 장치에있는 세포를 시딩 전에 수행할 수 있습니다. 그러나, 채널은 장치 단위 사이의 압력의 점성 손실을 방지하기 위해 충분히 크게 설계해야합니다.
비드 추적함으로써 특성화를 스트레인
2D 문화 시스템에 :
- 원하는 농도로 메탄올에, 1 μm의 직경 형광 구슬을 (피셔, IN 뱅스 연구소) 희석. 원래 농도 (비드 버퍼 용액에 1 % 고체)에서 1:150의 Dilutions는 우리의 요구에 적합한 것으로 판명되었습니다.
- 플라즈마는 장치 표면을 처리하고, 비드 정지 5-10 μL를 입금.
- 증발에 메탄올 기다립니다. 비드 농도가 너무 낮으면 반복합니다.
- 이미지 휴식 세포 문화 분야, 그리고 부하.
- 오픈 소스 자동 입자 추적 알고리즘은 다음 비드 변위를 추적하는 ImageJ (NIH)에서 사용할 수 있습니다.
- 변위 크기, 방향 및 위치 매개 변수는 다음 장치 표면에 스트레인 필드를 특성화하기 위해 수학적 모델에서 사용할 수 있습니다.
유사한 절차는 3D 시스템에 긴장을 특징으로 다음 수 있습니다. H에 형광 구슬의 수량을 혼합ydrogel 전구체 솔루션입니다. PEG의 히드로겔 시스템의 경우, 기공 크기는 1 μm의 직경 비즈보다 훨씬 작은 수 있습니다. 구슬은 히드로겔에 캡슐되며 시스템은 공촛점 현미경을 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다. 비드 변위는 다음 추적 분석 및 변형 모델에 장착되어 수 있습니다.
G. 대표 결과
장치 제조, 특성화 및 작업에 대한 결과는 그림 대표 5와 6에서 제공됩니다.
그림 1. 샌드위치 금형 제조 공정. (A) 오버헤드 투명 신중 SU - 8 마스터 uncured PDMS로 저하됩니다. (B) 샌드위치는 거품, 유리와 금속 스택에 배치하고, 압축 아래 오븐에 완치됩니다. (C) 스택은 분해와 투명성은 패턴 PDMS 레이어 3을 유지, 거리 벗겨 있습니다. 물리학 연구소의 승인에 의해 재현.
그림 2. (A) 휴식과 (B) 때 actuated에서 수직 actuated micropost의 도식. (C) 다층 제조 공정의 개략도 microposts 3 배열을 만들기 위해 필요합니다. 물리학 연구소의 허가에 의해 적응.
그림 3. deforming 2 차원 기판 7 교양 세포에 대한 실험을 수행하는 마이크로 액추에이터 배열을 수정하는 프로세스. 화학의 왕립 학회의 승인에 의해 재현 http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .
그림 4. 삼차원 photopatterned 히드로겔에서 교양 세포에 대한 실험을 수행하는 마이크로 액추에이터 배열을 수정하는 과정 구성 10. Elsevier의 허가에 의해 재현.
그림 5. 2D mechanostimulatory 문화에 대해 (A) 샘플 장치. 레드 염료의 윤활 채널을 표시하는 데 사용되는 작동 압력 전달 채널, 그리고 청색 색소를 표시하는 데 사용됩니다. 스트레인 특성화 실험 (B) 샘플 이미지. 녹색 반점이 변형 위치에게 7 나타내는 반면 붉은 반점은 구슬의 undeformed 위치를 나타냅니다. 화학의 왕립 학회의 승인에 의해 재현 http://dx.doi.org/10.1039/B914460A .
그림 6. 3D 압축 실험 (A) 샘플 장치. 그린 염료 작동 압력 채널을 표시하는 데 사용됩니다. (C) 히드로겔이 게시물의 위에 패턴 구축과 micropost 배열의 (B) 하향식 볼 수 있습니다. (D, E) 사이드 - 재건 히드로겔에서 형광 구슬의 이미지는 3D 문화 제도 10 변형 특성화 과정을 보여주는, (D) 휴식 (E) 55 kPa의 작동 압력에 따라 구성. Elsevier의 허가에 의해 재현.
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Discussion
개념 간단한지만, 장치 제조하지 몇 가지 실험적인 기술과 연습을. 특히 2D 세포 배양의 경우, 장치의 여러 레이어의 정렬은 특히 큰 지역 배열을 통해, 도전하실 수 있습니다. 실질적으로 말해서, 우리는 안정적으로 여러 레이어에 인접 기능 사이의 간격에 허용 오차 50 μm의와 장비를 사용하여 100 % 정렬 성공률을 얻을 수 있습니다. 우리는 또한 성공적으로 15 μm의 같은 낮은 허용 오차와 정렬을 보여주지만, 필요한 정렬 시간은 상당히 큰이며 낮은 성공률로 이루어진다. 배열에 photopattern biomaterials 수있는 마스크의 정렬은 마찬가지로 도전이지만, 게시물이 히드로겔 실린더에 비해 매우 큰하도록 설계된 수 있습니다,이 제약은 덜게.
다른 도전이 프로토콜의 설명 자료에 세포 배양을 포함하고 있습니다. 2D 스트레칭 시스템에서 문화 영화 단기 실험 생물 학적 조사를 제한으로 PDMS를 사용하여 기판에 세포 부착 등 상당히 자극 6 시간 이후에 영향을하기 시작합니다. 이것은 PDMS 표면 11, 또는 세포 접착력을 개선하고 실시 생물 학적 실험 12 유연성을 제공하는 더 많은 임상 관련성이 높은 폴리 우레탄 소재와 PDMS의 세포 배양 기판을 대체하여 covalently 바인딩 매트릭스 단백질에 의해 정류 수 있습니다. 설명 3D 시스템에서 히드로겔 화학은 설명의 예를 들어 전용으로 것입니다. 자기편 세포의 장기적인 문화가 다른 천연 또는 합성 hydrogels의 사용, 또는 (쉽게 표준 PEGylation의 화학을 사용하여 얻을 수 있습니다) PEG 매트릭스 13에 접착제 리간드의 포함이 필요합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 YS으로 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 및 건강 연구의 캐나다 연구소 (CHRPJ 323533-06), 온타리오 대학원 장학금 프로그램 CM하고, 마이크로 및 나노 엔지니어링 시스템에있는 캐나다 연구 의자로부터 재정 지원을 인정 와 CAS에 Mechanobiology 인치
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 PDMS Monomer and Crosslinker Kit | Dow Corning | ||
| SU-8 masters | |||
| Silanization agent: (tridecafluoro-1, 1, 2, 2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | United Chemical Technologies | ||
| Foam pads | Craft supply stores, 1-2 mm thick | ||
| Overhead inkjet transparencies | Grand Toy | ||
| Plexiglass plates | |||
| C-clamp | hardware store | ||
| Micromanipulator system | Siskiyou, Inc. | ||
| Custom-made vaccum mount | |||
| Vision system, Navitar 12x zoom | Navitar | ||
| Connecting tubes | VWR international | Clay Adam Intramedic PE190 | |
| Blunt 18G needles | Small Parts (www.smallparts.com) | ||
| Eccentric diaphragm micropump | Schwarzer Precision | SP 500 EC-LC4.5V DC | |
| Solenoid valves | Pneumadyne | S10MM-30-12-3 | |
| Solenoid manifold | Pneumadyne | MSV10-1 | |
| Function generator | |||
| 3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | ||
| Polyethylene glycol diacrylate 3.4 kDa | Laysan Bio Inc. | ||
| Polyethylene glycol 8 kDa | Sigma-Aldrich | ||
| Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | ||
| 1-vinyl-2-pyrolidinone | Sigma-Aldrich | ||
| Standard cell culture reagents |
References
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Schaffer, J. L. Device for the application of a dynamic biaxially uniform and isotropic strain to a flexible cell culture membrane. J Orthop Res. 12, 709-719 (1994).
- Jo, B., Lerberghe, L. V. an, Motsegood, K., Beebe, D. Three-dimensional micro-channel fabrication in polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer. Journal of Microelectromechanical Systems. 9, 76-81 (2000).
- Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. Solving the shrinkage-induced PDMS alignment registration issue in multilayer soft lithography. J. Micromech. Microeng. 19, 065015-065015 (2009).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Bongaerts, J., Fourtouni, K., Stokes, J. Soft-tribology: Lubrication in compliant PDMS-PDMS contact. Tribology International. 40, 1531-1542 (2007).
- Moraes, C., Chen, J. H., Sun, Y., Simmons, C. A. Microfabricated arrays for high-throughput screening of cellular response to cyclic substrate deformation. Lab on a chip. 10, 227-234 (2010).
- Liu, V. A., Bhatia, S. N. Three-dimensional photopatterning of hydrogels containing living cells. Biomedical Microdevices. 4, 257-266 (2002).
- Hahn, M. S. Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels. Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).
- Moraes, C., Wang, G., Sun, Y., Simmons, C. A. A microfabricated platform for high-throughput unconfined compression of micropatterned biomaterial arrays. Biomaterials. 31, 577-584 (2010).
- Wipff, P. J. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30, 1781-1789 (2009).
- Moraes, C. Integrating polyurethane culture substrates into poly(dimethylsiloxane) microdevices. Biomaterials. 30, 5241-5250 (2009).
- Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue engineering. 13, 2369-2385 (2007).
