Summary
DA sıçanlarda kronik relapsing deneysel otoimmün ensefalomyelit: Bu video, multipl skleroz bir hayvan modeli indüksiyonu ve klinik skorlama göstermektedir. Tüm sıçan omurilik ve tam Freund adjuvan içeren bir emülsiyon immunizing fareler tarafından uyarılan hastalık, insan hastalığına benzer klinik belirtiler sunar.
Abstract
Multipl skleroz (MS), genç erişkinlerde sık etkileyen santral sinir sistemi (MSS) kronik inflamatuvar bir hastalıktır. Bu, beyin ve omurilikte yaygın alanlarda demiyelinizasyon ve glial korkutuyorsun tarafından karakterize edilir. Bu lezyonlar, sinir iletim değiştirebilir ve CNS (örneğin paraparezi, felç, körlük, inkontinans) demyelinated plakların yerini değişir devre dışı bırakma nörolojik defisit neden.
Deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE), MS için bir model. EAE ilk tavşan omurilik yetişen virüsler kullanarak, insanlarda kuduz aşılama sırasında yanlışlıkla indüklenen oldu. Inaktive virüs omurilik enjekte edilen artıklar, merkezi sinir sistemi hastalığı kaynaklı. Bu gözlemlerin ardından, EAE ilk modeli nehirleri Homojenat ve 1935 yılında Schwenther MSS ile aşılanan insan olmayan primatlar olarak tarif edilmişti. EAE bu yana türlerin çeşitli oluşturulan ve türlerin / zorlanma ve antijen kullanılan immunizing bağlı olarak farklı ders takip edebilirsiniz. Aynı antijen kobay kronik bir hastalıktır neden olur Örneğin, adjuvan ile emülsiyon miyelin temel protein Lewis sıçanlarda immunizing, EAE akut modeli neden olur.
Burada açıklanan EAE modeli tam Freund adjuvan emülsiyon DA DA sıçan omurilik karşı sıçan immunizing tarafından indüklenir. Sıçanlar-bağışıklama sonrası 7-14 gün içinde artan bir flask paralizi gelişir. Klinik belirtiler birkaç hafta içinde bir relapsing-remitting seyir takip etmektedir. Patoloji, CNS ve demiyelinizasyon plaklar büyük immün infiltratlar gösterir. Videonun sonunda EAE ile hayvanların bakımı için özel dikkat edilmesi gereken noktalar açıklanmıştır.
Protocol
Kronik-relapsing EAE indüksiyonu ve izleme
Emülsiyon takviye tam Freund adjuvan eklendi sulu çözelti antijeni 1:1 karışımıdır. Bu antijen adjuvan ve başka bir yol boyunca eklemek için çok önemlidir!
Yapma ve bir emülsiyon enjekte atık bir sürü. 1.5 veya 2 kez her zaman için ihtiyaç duyduğunuz herşeyi daha fazla hazırlamak.
Otoklavlanmış harç, havaneli, cam şırınga, ve köprüler kullanın. Tüm plastik steril olmalıdır. Düzenli bir laboratuvar tezgahı üzerinde hazırlık yapılabilir.
1. Takviye adjuvan hazırlanması
Mycobacterium tuberculosis (Difco katalog # 231.141) ve bir havan topu yerleştirmek 30 mg tartılır. Bakteri kırılma önlemek için çok sert basmadan ince toz haline olun. Freund adjuvan H37Ra (Difco katalog # 231.131) ve karışımı tam 10 ml ekleyin. Bu takviye adjuvan 4 mg / ml, Mycobacterium tuberculosis içerir. Tüpüne aktarın.
2. Spinal kord Homojenat hazırlanması
-80 Dondurulmuş DA sıçan (yaş / cinsiyet kayıtsız) ve mağaza ° C omurilik toplayın Takviye adjuvan: 1:1 (hacim ağırlığı) karıştırmak için yeterli donmuş omurilik tartılır. Bir jilet ile mümkün olduğunca ince olarak omurilik Kıyma, 1. kısımda kullanılan harç transferi ve havaneli bir hamur yapın.
3. Emülsiyon hazırlanması
- Place bir tüp Freund adjuvan tam desteklenmiştir. Yüksek hızda karıştırın. Vorteks ise omurilik Homojenat damla damla ekleyin. omurilik Homojenat tüm eklenir, 5 dakika daha karıştırın. Bu karışım hafif pembe açmalısınız.
- 5 ml cam şırınga içinde koyun ve emülsiyon (Fisher katalog # 14-825-17L) 18G köprü kullanarak başka bir 5 ml cam şırınga bağlamak. (5-10 dk) sabit hale gelinceye kadar, diğer bir şırınga emülsiyon gönder. Emülsiyon 5 ml 'den fazla hazır ise, birkaç 5 ml şırınga büyük şırınga KULLANMAYIN kullanın.
- Emülsiyon şırınga 4 ° C'de 3 hafta süreyle saklanabilir. Ben onu yıkmak değildir kontrol etmek için en az 12 saat önceden hazırlanması tavsiye ederiz. Bu kalın ve 2 faz ayrı kalmalıdır. Rengi sarı veya bej bir ışık gecede değişecektir.
4. Sıçan, Bağışıklama
- Birkaç dakika için şırınga emülsiyon karıştırın ve enjeksiyon için kullanılan şırınga transfer. 200 ul, çok kısa süreli anestezi altında 23G iğne ve 3 ml Luer-Lock şırınga kullanarak kuyruk dibinde subkutan enjekte edilir.
- Alıcılar 7-9 hafta eski kadın DA sıçan. Harlan Sprague Dawley sıçan olsun.
- Sıçanlar günde iki kez gözlenen ve günlük olarak değerlendirilmelidir. Klinik bulgular emülsiyon enjeksiyondan sonra 7-15 gün bekleniyor.
Klinik skorlama:
0: Herhangi bir hastalık
0.5: distal gevşek kuyruk
1: gevşek kuyruk
2: orta şiddette paraparezi, ataksi
3: orta derecede paraparezi, zaman zaman sıçanlarda gezileri
3.5: bir arka bacak felç, diğer hamle
4: tam arka ekstremite paralizisi
5: komple arka bacak felci ve inkontinans
6: can çekişen, nefes alma zorluğu, yemek veya içmek değildir. Hemen Euthanize.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol için birkaç önemli hususlar vardır.
DA sıçanlarda Genetiği satın hangi damızlık bağlı olarak biraz farklı olacaktır. Bu farklılıklar, indüksiyon EAE sıçan yatkınlık artabilir veya azalabilir. Sıçanlarda EAE daha duyarlı iseniz olmayan takviye tam Freund adjuvan hatta eksik Freund adjuvan kullanarak bağışıklama gücü azaltmak istiyorsanız. Ayrıca emülsiyon hazırlarken önce enjekte emülsiyon miktarını azaltarak ya da, tuzlu su ile omurilik Homojenat seyreltilmesi düşünebilirsiniz. Sıçan, emülsiyon, konut tesisin temizliği kontrol immunizing tam gücü kullanarak EAE klinik belirtileri ortaya çıkmaz. Parazitler (kıl kurdu olarak) ile enfekte Sıçanlar EAE geliştirmek. Otoklavlanmış kafeslerde filtre üstleri ile temiz koşullar altında hayvanların barınma ve onları asitlendirilmiş su ad libitum (asitlendirilmiş su hazırlanması için protokol bağlı) vererek düşünebilirsiniz.
Emülsiyon, su-yağ olmalıdır, böylece petrol adjuvan tamamen kat damla damla antijen. Bir emülsiyon (yağ-su) başka bir yol yuvarlak kalın gibi olacak hazırlanmıştır ancak encephalitogenic olmayacaktır.
Sıçanlar dostu hayvanlar onların işleyicisi alışkın iseniz, bu nedenle encephalitogenic emülsiyon enjeksiyondan önce günlük bazda hafifçe bunları işlemek için iyi bir fikirdir. Bu stres ve bir ısırık riskini azaltacaktır.
Animals şiddetli EAE (3 veya daha fazla puan) ile özel bir bakıma ihtiyacı. Sıçanlar kuyruk değil, vücut tarafından toplanan asla. Bu hasta hayvanlarda stres azaltmak için daha da önemli. Bu, bütün hayvanlar, gıda ve jel paketleri yataklar koyarak ve su şişeleri üzerinde uzun sipper tüpler gıda ve suya erişimi olmasını sağlamak için çok önemlidir. Sıçanlar EAE ile bir hayvan durdurmak ya yemek ya da enstitünün veteriner hekimin içme eğer, yeme ve içme devam etme veya hayvan euthanize. Hasta sıçanlarda sağlamak onlar sürekli ayaklar altına değil, ancak tek başına bırakarak sıçanlarda önlemek, sosyal hayvanlardır ve şirketin ihtiyaç sağlıklı hayvanlardan ayrılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CB ve KGC Airmid A.Ş. kurucularından ve danışmanlar
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Freund’s Adjuvant | Reagent | Fisher Scientific | DF 311-360-5 | Manufactured by Difco |
| Mycobacterium tuberculosis H37Ra | Reagent | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Manufactured by Difco |
| DA rat | Animal | Harlan Laboratories | Females, 7-9 weeks old. | |
| Glass syringes - 5 ml | Tool | Fisher Scientific | 14-823-10 B | |
| Metal bridge - 18G | Tool | Fisher Scientific | 14-825-17L | |
| Luer Lok plastic syringes - 3 ml | Tool | BD Biosciences | 309585 | |
| Needles - 20G 1 1/2 | Tool | Fisher Scientific | 14-826-5C |
