Summary
Negli insetti, la oenocytes produrre composti di idrocarburi cuticolare. Questi composti proteggono essiccazione e facilitare la comunicazione chimica. Qui mostriamo una tecnica di dissezione utilizzati per isolare il oenocytes da adulti
Abstract
In
Protocol
Parte 1. Preparazione Filetto dell'addome adulti Drosophila.
La procedura descritta immediato sotto l'addome si prepara per la successiva eliminazione del oenocytes (vedi Part2 di protocollo). La stessa procedura può essere utilizzata anche per la preparazione di altri tessuti attaccati alla superficie interna della cuticola, tra cui il vaso dorsale (cioè il cuore) e del grasso corporeo.
Da notare che nell'articolo il video della tecnica dissezione oenocyte è dimostrata su un adulto wild-type (Canton-S) moscerino maschio, sei giorni di età. Tecniche identici possono essere utilizzati per rimuovere il oenocytes dalle mosche di sesso femminile. La preparazione filetto addome dura circa 5 minuti per eseguire.
Prima di iniziare è importante avere pronto pin diversi dissezione fine (vedi sotto e Parte 2) e un ago da dissezione (vedi parte 2). Pin dissezione disponibili in commercio e gli aghi sono spesso troppo grandi per questo protocollo, così abbiamo preso a fabbricare la nostra in laboratorio. Per creare l'ago dissezione, filo di tungsteno (0,005 ") è il primo threaded attraverso l'albero di ago ipodermico (27G, mozzo in alluminio). Infilare il filo attraverso la punta di un ago ipodermico in modo che emerge dal mozzo. Fissare il filo sporgente dal mozzo;. questo impedisce al filo di essere tirato fuori l'ago ipodermico Successivamente, tagliare il filo dalla parte opposta del crimpare tale che parecchi millimetri (~ 3-4mm) di filo sporgono dalla punta dell'ago ipodermico Passing. la punta di tungsteno esposte attraverso una fiamma sarà affinare il filo ad un punto molto fine. Una pipetta di plastica usa e getta da 5 ml when incuneato nel mozzo dell'ago ipodermico agisce come comoda maniglia per questo strumento di dissezione. I perni dissezione belle sono fatte in un simile modo. Dopo la fase di affinamento, afferrare la punta del filo saldamente con una pinza per impedire che si sposti e fare un taglio di circa 3 mm dalla punta per liberare il perno piccolo dissezione. Fare attenzione per evitare che pin di essere gettata dalla presa di le pinze.
Per preparare il filetto addome adulto Drosophila:
- Fissare il volo alla piastra dissezione (Sylgard;-Dow Corning) inserendo un pin multa dissezione se il torace.
- Rimuovere le gambe e le ali della mosca. Durante la rimozione del set più posteriore delle gambe, creare un'apertura nella cuticola al punto giusto anteriore del torace, dove incontra l'addome. Questa apertura è utilizzato in seguito come punto di accesso per fare un'incisione lungo la superficie ventrale dell'addome (vedi punto 5)
- Fissare l'addome della mosca sul posto mettendo un secondo perno dissezione attraverso il segmento genitale.
- Coprire il volo con Shields refrigerati e Sang M3 insetti medio (Sigma). Rimuovere l'aria intrappolata disegnandolo con una pipetta Pasteur.
- Utilizzando pinze aperto l'addome facendo un'incisione lungo la linea mediana ventrale dall'apertura nella cuticola creato rimuovendo le gambe al segmento genitale. Togliere il fegato e gonadi dall'addome.
- Sever la cuticola e trachee collega l'addome al torace. L'unico tessuto rimanente collega l'addome al torace dovrebbe essere il cuore. Questo fornisce la cuticola addominale con una certa stabilità, e ne impedisce la rotazione o torsione durante il passo successivo.
- Perno del piatto anteriore più angoli della cuticola addominale. Rimuovere il torace. Tirare la cuticola teso, pin piatti gli angoli posteriori della cuticola. Il perno del segmento genitale può avere bisogno di essere riposizionati per rendere la cuticola distesi.
Parte 2. Dissezione Oenocyte
La preparazione filetto addome espone la superficie interna della cuticola addominale e dei tessuti attaccati compreso il cuore, grasso corporeo, trachee, muscoli della parete del corpo, l'epidermide, e il oenocytes. Il cuore si trova lungo la linea mediana dorsale. Grasso corporeo (tessuto opaco) copre la maggior parte della superficie interna cuticolare. Trachee (bianco strutture tubolari) si estendono dalle aperture spiraglio laterale, e fare i rami ampio che si infiltrano questi tessuti. Giacciono sotto questi tessuti, l'oenocytes pigmentate (di colore ambrato cellule) irradiano dalla linea mediana verso il bordo laterale della cuticola nella regione posteriore di ogni segmento. Il oenocytes trovano direttamente sotto le regioni rese scure dal sole di ogni tergite (dorsale piastre cuticolare) e possono essere difficili da identificare senza una preventiva conoscenza della loro posizione. Un'altra popolazione di oenocytes ventralmente trova è associato con il sterniti (ventrale piastre cuticolare), anche se è possibile isolare queste cellule, questo protocollo video solo dimostrare la dissezione del oenocytes dorsale. In ogni segmento addominale, una foglia di spicco del tessuto grasso corporeo si trova anteriormente al oenocytes; una foglia più piccola meno evidente di grasso corporeo è posteriore al oenocytes. La foglia di spicco del tessuto grasso corporeo spesso copre il oenocytes del segmento che lo precede. Il vaso dorsale e il corpo grasso deve essere rimosso in primo luogo per esporre il oenocytes.
E 'importante notare che la pigmentazione ambra del oenocytes, da cui il loro nome deriva (eno - dal greco Oinos,' vino ') 1, distingue chiaramente queste cellule dai tessuti circostanti, l'intensità della pigmentazione aumenta con l'età della mosca. Inoltre, una lamina basale ensheathes il oenocytes 2,3, fornendo supporto per i cluster di cellule e impedendo alle cellule di diventare dissociata durante la dissezione. La lamina basale aiuta anche nella rimozione di tessuti extraneously aderito, come il tessuto grasso corporeo, creando un punto debole in cui tali adesioni possono essere facilmente perturbato.
La procedura descritta di seguito fornisce istruzioni dettagliate per la rimozione del oenocytes dal tegumento addominale. Il oenocytes può essere facilmente rimosso dalla segmenti addominali 2-5 (maschio), e 2-6 (femmina). Il oenocytes dai segmenti addominali prima e l'ultima (segmenti 1, e 6 nei maschi o 7 nelle femmine) sono spesso interrotta da i pin dissezione tenendo gli angoli della cuticola e sono quindi evitati. La rimozione del oenocytes dura circa 10 minuti per eseguire.
Per isolare il oenocytes adulti:
- Tagliare i tronchi tracheali provenienti dal spiracoli usando un ago dissezione.
- Togliere il grasso corporeo e il cuore da recidere le connessioni con la superficie interna della cuticola con un ago da dissezione. Per farlo, posizionare il punto dell'ago dissezione tra il corpo grasso e il oenocytes, e trascinarlo dal bordo laterale della cuticola, fino alla linea mediana, in movimento sotto il cuore, e continuando a lato opposto. Progredendo dal anteriore a posteriore, rimuovere il tessuto grasso corporeo e il cuore dalla cuticola di ogni segmento successivo. Se eseguita correttamente il oenocytes rimangono attaccati alla cuticola, e il grasso corporeo e il cuore può essere rimosso tutto.
- Parete del corpo i muscoli della cinghia oenocytes alla superficie interna della cuticola. Utilizzando l'ago dissezione rompere il muro longitudinale muscoli del corpo di ogni segmento. Per fare ciò, trascinare l'ago dissezione lungo il lato posteriore del filamento oenocyte, sollevando delicatamente dalla superficie della cuticola. I fili oenocyte nastro come dovrebbe venire via dalla cuticola e può essere posato su un fianco mentre i restanti oenocytes vengono rimossi.
- Una volta tolto dal cuticola, che giace sul piatto dissezione può essere necessario per pulire ogni aderito al tessuto di grasso corporeo dal oenocytes. Questo viene fatto semplicemente posizionando l'ago dissezione tra il tessuto grasso corporeo e la oenocytes, e recidendo la connessione premendo l'ago verso il basso e contro la piastra dissezione.
- Raccogliere i fili oenocyte semplicemente li frugando con la fine dell'ago dissezione. Una volta attaccato alla fine l'ago della dissezione oenocytes può essere tirato lentamente sulla superficie del terreno di coltura. Il oenocytes sezionato può essere posizionato direttamente nel buffer di lisi cellulare appropriato sia per estrazione RNA o proteine. Si noti che il oenocytes (segmenti addominali 2-5) da una mosca singolo maschio produce tipicamente 15-20ng di RNA totale.
Figura Legenda:
Figura 1. Espressione dei geni desaturasi, desat1 e desatF, in oenocytes maschili e femminili di D. melanogaster. trascrizione inversa-PCR amplificazione di desat1 e desatF da cDNA derivati da adulti oenocytes maschile e femminile. Il gene è espresso in desat1 oenocytes sia maschili che femminili; espressione desatF è dimorfismo sessuale, espressi esclusivamente in oenocytes femminile. Corrispondenti a queste differenze di espressione genica, desat1 è necessario per la produzione di composti di idrocarburi comune a maschi e femmine 9 e desatF è coinvolta nella produzione di femmina-specifici composti di idrocarburi 10,11. DesatF ha dimostrato di essere specificatamente espresso in oenocytes femminile in 12 ibridazione in situ. Si noti che, in media 15-20ng di RNA totale si ottiene dalla oenocytes sezionato da un singolo volo. RNA è stato isolato utilizzando il RNeasy micro kit (Qiagen); cDNA è stata prodotta utilizzando il qScript cDND sintesi kit (Quanta BioSciences)
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Discussion
In questo articolo vi presentiamo il video di un protocollo dettagliato dissezione per la preparazione della oenocytes da adulto D. melanogaster, in modo idoneo per l'analisi molecolare. Un testo basato su abbreviato conto del metodo di dissezione è stata descritta in altri 2, e la preparazione risultante oenocyte ha dimostrato di essere adatto per l'estrazione di RNA e proteine sia 2. Utilizzando questa preparazione può anche essere possibile sviluppare metodi per la coltura di oenocytes espiantati. Un protocollo per una cultura espianto oenocyte sarebbe facilitare le indagini volte a determinare la capacità autonoma del metabolismo di queste cellule di sintetizzare e secernere le componenti chimiche degli idrocarburi cuticolare. Queste tecniche in combinazione con un recente sviluppo oenocyte-GAL4 linea 4, che permette la manipolazione genetica mirata del oenocytes, consentirà la dettagliata analisi di genetica molecolare della funzione oenocyte nel moscerino della frutta adulti.
Oenocyte cellule si trovano sia nella larva e la mosca adulta. Mentre queste cellule condividono molte somiglianze morfologiche ed ultrastrutturali, è importante notare che la oenocytes della mosca adulti sono evolutivamente distinti da quelli che differenziano durante lo sviluppo embrionale e durante esistono stadi larvali 5. Il oenocytes adulti sono stati segnalati per essere derivato dal histoblasts 6, formando de novo durante impupamento e continua ad aumentare di numero durante la prima settimana di vita adulta 7. Mentre il oenocytes del moscerino della frutta adulti sono necessari per la produzione di idrocarburi cuticolare 4, rimane da stabilire se oenocytes larvale supportare una funzione simile. Allo stesso modo, oenocytes larvale mantenere epatociti-come funzioni in relazione al metabolismo dei lipidi 8; un ruolo simile non è ancora stato mostrato per la oenocytes dell'adulto. La preparazione ha dimostrato qui facilitare le indagini che hanno lo scopo di determinare il grado in cui il oenocytes larve e adulti sono funzionalmente simile.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Amsale Assicuratori per la sua assistenza in riprese di questo articolo video. Questo lavoro è stato finanziato dalla CIHR, NSERC e sovvenzioni CRC JDL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | ||
| Tungsten Wire | Ted Pella, Inc. | 27-11 | 0.005”/20’ |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| qScript cDNA Synthesis Kit | Quanta Biosciences | 95047-100 | |
| Monoject Hypodermic Needle | Harvard Apparatus | 722289 | 20G1 with aluminum hub |
References
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