Summary
Dit protocol beschrijft een niet-virale manier van levering van genetische constructen tot een bepaald gebied van wonen knaagdieren hersenen. De methode bestaat uit plasmide voorbereiding, micropipet fabricage, neonatale rattenpup chirurgie, micro-injectie van het construct, en
Abstract
Creatie van transgene dieren is een standaard aanpak in het bestuderen van de functies van een gen van belang in vivo. Echter veel knock-out of transgene dieren zijn niet levensvatbaar zijn in die gevallen waarin het gemodificeerde gen wordt uitgedrukt of verwijderd in het hele organisme. Bovendien is een aantal compenserende mechanismen maken het vaak moeilijk om de resultaten te interpreteren. De compenserende effecten kunnen worden verlicht door ofwel de timing van de gen-expressie of het beperken van de hoeveelheid van de getransfecteerde cellen.
De methode van postnatale non-ventriculaire microinjectie en in vivo elektroporatie maakt gerichte toediening van genen, siRNA of kleurstofmoleculen rechtstreeks naar een kleine regio van belang in de pasgeboren knaagdieren hersenen. In tegenstelling tot conventionele ventriculaire injectietechniek, deze methode maakt het mogelijk transfectie van niet-trekkende celtypen. Dieren getransfecteerd door middel van de hier beschreven methode kan worden gebruikt, bijvoorbeeld voor twee-foton in vivo imaging of in elektrofysiologische experimenten op acute hersenen plakjes.
Protocol
1. Introductie
Creatie van transgene dieren is een krachtige methode van onderzoek van de genetische functies in levende dieren en een voor het ontrafelen van de ziekte-mechanisme 2,3 evenals voor het manipuleren van de eigenschappen van cellen 4. Echter, de procedure is nogal bewerkelijk, zeer tijdrovend en duur, zo rechtvaardigt het gebruik van alternatieve gen delivery methoden zoals virale injectie 5, neonatale ventriculaire injectie met elektroporatie 6 en in de baarmoeder elektroporatie 7,8. De methode van postnatale non-ventriculaire injectie en elektroporatie heeft een unieke set van voordelen: gebruik van niet-virale genetische constructen, de mogelijkheid om een lokale uitdrukking patroon in het gebied van belang te creëren, in situ transfectie van niet-trekkende soorten cellen, zoals corticale astrocyten.
In deze video, tonen we de gedetailleerde procedure van postnatale gen levering aan de neonatale rat hersenen met behulp van een plasmide dat codeert voor de verhoogde green fluorescent eiwit onder kip beta actine-promotor met CMV enhancer (pCAG-EGFP) 9. We illustreren de bereiding van het plasmide-bevattende oplossing voor injectie, productie van dunne glazen pipetten en assemblage van de microinjector op een stereotactische instrument. Dan praten we over verdovende jonge ratten met isofluraan, over het uitvoeren van de operatie, over de injectie procedure en over de elektroporatie met behulp van pincet elektroden en de in vivo porator. Tot slot bespreken we kort de verwachte resultaten, perspectieven en problemen die zich kunnen voordoen tijdens deze experimenten.
2. Plasmide Voorbereiding voor Elektroporatie
- We meestal voor te bereiden 10 ul van het plasmide injectie oplossing in een 200 ul dunne wand buis. Deze oplossing is voldoende voor een aantal experimenten.
- We mix 8 ul van het plasmide-oplossing (zie materialen en apparatuur) met 1 pi van de 10X PBS (zie materialen en apparatuur) en een pi van 0,1% snel groen water-oplossing (zie materialen en apparatuur).
- De uiteindelijke concentratie van het plasmide in de injectie-oplossing moet worden tussen de 1 en 3 ug / ul. Lagere concentraties van plasmide DNA vermindert de transfectie-efficiëntie, terwijl de hogere DNA-concentratie zal ook viskeuze voor injectie worden door de dunne uiteinde van de glazen capillair.
3. Glas Naald Voorbereiding
- Voor de glazen pipet voorbereiding maken we gebruik van borosilicaatglas capillair met een gloeidraad (zie materialen en apparatuur) en een verticale glazen elektrode trekker (zie de materialen en apparatuur) op maximum te trekken en verwarming parameters.
- Vervolgens hebben we breken de punt van de pipet met behulp van een stukje papier om een tip 10-20 micrometer in diameter bereiken.
- Wij controleren de tip diameter en de vorm onder de microscoop doelstelling.
4. Microinjector Montage
- Met behulp van een dunne polymeerlaag capillair (zie materialen en apparatuur) vullen we ongeveer 1 / 3 van het volume van een 10 ul Hamilton spuit (zie materialen en apparatuur) met minerale olie (zie materialen en apparatuur). Vermijd luchtbellen!
- Vervolgens vullen we de glazen pipet met minerale olie en steek de pipet in de Hamilton spuit. Vermijd luchtbellen!
- De spuit met glazen pipet wordt vervolgens vastgesteld op de microinjector aangesloten op een controller (zie materialen en apparatuur).
- De micro-injectie setup bevestigd op een stereotactische instrument (zie materialen en apparatuur) laat ons toe om het uiteinde van de glazen pipet veilig onder te dompelen in de buis met het plasmide oplossing voor injectie.
- Wanneer de tip het oppervlak van de oplossing raakt, dip het verder door 1 of 2 mm en vul de pipet met ongeveer 1 pl van de injectie mengen met behulp van de micro-injector controller.
5. Verdovende dier
Alle procedures die hier werden uitgevoerd volgens de Universiteit van Helsinki regelgeving voor dierproeven.
- Voor elk experiment, vullen we een gasdichte injectiespuit (zie materialen en apparatuur) met ongeveer 2 ml van isofluraan (zie materialen en apparatuur).
- Dan de spuit wordt bevestigd op de anesthesie-eenheid (zie materialen en apparatuur) is aangesloten op de luchtstroom bron, het dier doos en het masker vast op stereotactische setup.
- Op de anesthesie apparaat, passen we de luchtstroom tot ongeveer 250 ml / min en de isofluraan niveau tot 4%.
- We plaatsen de rat pup in het dier box voor 2-5 minuten.
- Als de pup stopt met bewegen, plaats het op het verwarmingselement (zie materialen en apparatuur) aan de stereotactische setup.
- Plaats een rostrale deel van pup het hoofd in de verdovende masker.
- Het duurt 5 tot 10 minuten voor depup naar de diepe narcose te gaan.
- Controleer anesthesie diepte met een staart knijpen en afname van de instroom isofluraan om ongeveer 1,5 tot 2,0%.
6. Chirurgie, micro-injectie en elektroporatie
- Behandel de huid op de pup het hoofd met de 70% ethanol.
- Met behulp van een klein schaartje (zie materialen en apparatuur) en dunne tang (zie materialen en apparatuur), snijd de huid van een nekvel van de pup aan zijn voorhoofd.
- Zijwaarts buigen huid stukken en trek het oor bars iets in auditieve openingen van de schedel voor hoofd en huid fixatie.
- Met behulp van een binoculaire microscoop, zoeken we de bregma punt op de schedel.
- Identificeer de regio van belang het gebruik van de stereotactische coördinaten.
- Plaats de injectie pipet boven dit gebied en markeer dit door te laten vallen 25-50 nl van de injectie-oplossing op de schedel oppervlak.
- Boor de schedel zachtjes en voorzichtig op de gemarkeerde punt met behulp van een hoge snelheid chirurgische boor (zie materialen en apparatuur) onder de microscoop tot vloeistof verschijnt in het geboorde gebied.
- Fix een electropotation pincet elektroden (zie materialen en apparatuur) aan de zijkanten van de schedel met de huidige geleidende gel (zie materialen en apparatuur) om een betere geleiding te bereiken.
- Verwijder de vloeistof in het boorgat met behulp van kleine tampon (zie materialen en apparatuur) en dompel het glas naald om het gat op basis van de coördinaten van de plaats van injectie.
- Trekken 25 tot 100 nl van de injectie-oplossing tegen het tarief van 5 tot 20 nl / sec.
- Snel verwijderen van de pipet en electroporate onmiddellijk. Elektroporatie wordt gedaan door het toepassen van vijf rechthoek pulsen met de duur van 50 ms en een amplitude van 99 V op de frequentie van 1 Hz.
- Verwijder de elektroden en oor bars.
- Naai de cut huid met behulp van een combinatie van een stomme (zie materialen en apparatuur) en scherpe tang en chirurgische onderwerpen (zie de materialen en apparatuur).
- Plaats de pup in de warme kamer voor 15-30 minuten om zijn herstel na anesthesie hulp.
- Dan zet de pup terug naar zijn moeder kooi.
7. Representatieve resultaten
De expressie van het transgen in het succes getransfecteerde cellen zal verschijnen ongeveer 10 uur na de elektroporatie, en het stabiel blijft gedurende enkele weken.
We gemicroinjecteerd het plasmide ofwel in een diepe corticale lagen of striatum gebied van postnatale dag 2 (P2) Wistar ratten pups en uitgevoerd in vivo elektroporatie zoals hierboven beschreven. Brain plakken (400 um in dikte) werden gesneden na 2 tot 6 dagen (P4-P8) met behulp van een vibrotome in koud snijden medium (Hepes gebufferd Balanced Salt Solution Earle's) 10. Afbeelding acquisitie werd uitgevoerd met behulp van Zeiss Axioplan 2 LSM5 Pascal confocale microscoop (Zeiss, Duitsland) in het snijden medium bij kamertemperatuur.
De injectieplaats in diepe corticale lagen en striatum bevatte veel getransfecteerde cellen die EGFP die zich in een compact gebied van ongeveer 200-300 micrometer in diameter (figuur 1A, B). Binnen de getransfecteerde cellen, het EGFP expressie niveau hoog genoeg is om beeldvorming van dunne cellulaire processen (figuur 1C) met inbegrip van dendrieten met stekels van verschillende vormen (figuur 1D) en axonen bundels (figuur 1E). De robuuste stabiliteit van EGFP en levensvatbaarheid van de cellen na elektroporatie toegestaan traceren distale delen van axonen (tot 1,5 tot 2 mm van cellichamen) zoals corticale terminals (Figuur 1F).
Figuur 1. (A) succesvol getransfecteerde cellen in het striatum regio van P4 hersenen van de rat de afbakening van de plasmide injectieplaats. (B) Getransfecteerde cellen in diepe corticale lagen (circa 1000 pm onder corticale oppervlak) van P5 hersenen van de rat. (C) Een getransfecteerde cel in het striatum regio van P8 hersenen van de rat. (D) Dendritische processen van een getransfecteerde cel in het striatum regio van P8 hersenen van de rat; pijlen geven de verschillende soorten dendritische spines en filopodia. (E) axonen van getransfecteerde cellen in onderpand pad. (F) Axonen eindigen op de pial oppervlak van P8 rat cortex (pijlpunt). Schaal bars zijn 100 um op A, B, E en F; 10 urn op C en D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Methoden van gen delivery in levende knaagdieren hersenen zijn goed ingeburgerd in utero elektroporatie 7,8,11,12 en, meer recentelijk, voor postnatale elektroporatie 6. Echter, deze methoden op basis van intraventriculaire injectie van het plasmide DNA, die kunnen worden beperkt voor verschillende toepassingen. Bijvoorbeeld, hebben deze methoden niet toe richten cellen in bepaalde hersengebieden, zoals de hippocampus, noch transfectie van dergelijke niet-trekkende soorten cellen zoals corticale astrocyten. Niet-ventriculaire injectie in combinatie met elektroporatie werd voor het eerst gebruikt voor gen in het cerebellum neuronen 13. Ons protocol illustreert de uitbreiding van de niet-ventriculaire methode voor andere regio's van hersenen van de rat. Wij stellen voor dat onze methodologische aanpak is een nuttig alternatief voor de virale methoden van gen-levering aan de beperkte gebieden van belang in postnatale hersenen van de rat 5.
Ondanks de voordelen van de onderhavige werkwijze, kan een aantal problemen worden verwacht, zoals hieronder besproken.
1.Optimal leeftijd van het dier
Indien mogelijk, moeten jonger neonatale rat pups worden gebruikt, als een middel om zowel de transfectie effectiviteit en overleving van jongen te verhogen na de operatie. In onze handen, de P0 pups te klein zijn omdat het moeilijk is om reproduceerbaar richten op een bepaald gebied in de hersenen met behulp van stereotactische coördinaten verkregen uit de hersenen atlas beschikbaar voor deze 14 jaar. Daarnaast heeft de P0 pups hebben dunne en gevoelige huid die kunnen belemmeren naaien. De P3 en P4 zijn het meest geschikt in termen van chirurgische en stereotactische manipulaties in vergelijking met P0-P2 dieren, maar ze hebben een overgevoeligheid voor isofluraan anesthesie die epileptische aanvallen en ademhaling onderbrekingen kan veroorzaken tijdens de operatie. Zo is de beste optie is P1-P2 jonge ratten, die voorspelbaar zijn tijdens de operatie en groot genoeg voor reproduceerbare micro-injecties.
2.Possible problemen met de micro-injectie
Wanneer kleine hoeveelheden van de oplossing (25-100 nl) worden geïnjecteerd door middel van dun glas tip om het hersenweefsel oefent een tegengestelde druk, is het essentieel dat luchtbellen of lekkages zorgvuldig worden vermeden. Zich niet aan deze te vermijden, kan leiden tot een dramatische afname van de transfectie-efficiëntie.
3.Precision limieten voor stereotactische coördinaten
Ondanks de nauwkeurigheid van stereotactische coördinaten, hebben ze een limiet op 0,3 mm reproduceerbaarheid 15. In onze ervaring met dieren van dezelfde leeftijd en het gewicht is het mogelijk om deze limiet te verlagen tot 0,2-0,1 mm, wat voldoende is voor reproduceerbare doelgerichtheid van de hippocampus CA1 gebied.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken Ekaterina Karelina voor hulp bij het opnemen van soundtrack voor de video, Ivan Molotkov voor 3D animatie en dr. Peter Blaesse voor CAG-EGFP-plasmide voorbereiding.
Het werk werd ondersteund door subsidies van het Centrum voor Internationale Mobiliteit van Finland, de Finse Cultural Foundation en de Academie van Finland.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | equipment | XYtronic | XY-2A-SA | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | equipment | Supertech | TMP-5b | |
| Borosilicate tube with filament | material | Sutter Instrument Co. | BF120-69-10 | Glass needle |
| Disposable drills | material | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | reagent | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | equipment | Fine Science Tools | 91150-20 | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Ealing micr–lectrode puller | equipment | Ealing | 50-2013 | Vertical electrode glass puller |
| Ethilon monofil polyamide 6-0 FS-3 16 mm 3/8c | material | Johnson & Johnson | EH7177H | Surgical threads |
| Exmire micro syringe 10.0 ml | equipment | Exmire | MS*GLLX00 | Gas-tight syringe |
| Fast Green | reagent | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Forceps electrodes | equipment | BEX | LF650P3 | Treat with 70% ethanol for disinfection prior to use |
| Foredom drill control | equipment | Foredom | FM3545 | Surgical drill power supply and control. Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom) |
| Foredom micro motor handpiece | equipment | Foredom | MH-145 | Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom) |
| Gas anesthesia platform for mice | equipment | Stoelting Co. | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Isoflurane | reagent | Baxter Internationl Inc. | FDG9623 | |
| Micro dressing forceps, 105 mm | equipment | Aesculap | BD302R | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Microfil | material | World Precision Instruments, Inc. | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | reagent | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | equipment | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | Hamilton syringe |
| plasmid CAG-EGFP | reagent | Extracted and purified with EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) and dissolved in nuclease free water to concentration 1.5 mg/ml | ||
| Pulse generator CUY21Vivo-SQ | equipment | BEX | CUY21Vivo-SQ | |
| Schiller electrode gel | reagent | Schiller AG | 2.158000 | Conductive gel |
| Small animal stereotaxic instrument | equipment | David Kopf Instruments | 900 | |
| St–lting mouse and neonatal rat adaptor | equipment | Stoelting Co. | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument.Treat earbars with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | equipment | Fine Science Tools | 91460-11 | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Sugi absorbent swabs 17 x 8 mm | material | Kettenbach | 31602 | Surgical tampons |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | equipment | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Univentor 400 Anesthesia Unit | equipment | Univentor | 8323001 |
References
- Gerlai, R., Clayton, N. S. Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci. 22, 47-51 (1999).
- McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. A decade of modeling Alzheimer's disease in transgenic mice. Trends Genet. 2, 281-289 (2006).
- Cryan, J. F., Holmes, A. The ascent of mouse: advances in modeling human depression and anxiety. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 775-790 (2005).
- Wells, T., Carter, D. A. Genetic engineering of neural function in transgenic rodents: towards a comprehensive strategy. J. Neurosci. Methods. 108, 111-130 (2001).
- Pilpel, N. reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J. Neurosci. Methods. 182, 55-63 (2009).
- Boutin, C. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3, e1883-e1883 (2008).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101, 16-22 (2004).
- De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
- Walantus, W. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. , (2007).
- Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 16182-16187 (2007).
- Ashwell, K., Paxinos, G. Atlas of the Developing Rat Nervous System. , 3rd edition, Academic Press. (2008).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 6th edition, Academic Press. (2007).
