Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה שאינה ויראלי מסירת בונה גנטית באזור מסוים של המוח מכרסם החי. השיטה מורכבת הכנה פלסמיד, ייצור micropipette, ניתוח חולדה בילוד הגור, microinjection של לבנות, ואת
Abstract
יצירת חיות טרנסגניות היא הגישה הסטנדרטית בלימוד פונקציות של הגן של עניין in vivo. עם זאת, רבים בנוקאאוט או חיות טרנסגניות אינם קיימא באותם מקרים שבהם הגן מתבטא שונה או נמחק בתוך האורגניזם כולו. יתר על כן, מגוון של מנגנוני פיצוי לעתים קרובות לעשות את זה קשה לפרש את התוצאות. ההשפעות הפיצוי ניתן להקל על ידי תזמון גם את ביטוי הגנים או להגביל את כמות התאים transfected.
שיטת microinjection חדרית בלתי הלידה והן electroporation vivo מאפשר משלוח ממוקד של גנים, siRNA או מולקולות צבען ישירות באזור קטן של עניין במוח מכרסם היילוד. בניגוד הטכניקה המקובלת חדרית הזרקה, שיטה זו מאפשרת transfection שאינם נודדים סוגי תאים. בעלי חיים transfected באמצעות השיטה המתוארת כאן ניתן להשתמש, למשל, עבור שני הפוטונים in vivo הדמיה או בניסויים אלקטרו על פרוסות המוח חריפה.
Protocol
1. הקדמה
יצירת חיות טרנסגניות היא שיטה רבת עוצמה של חקירה של פונקציות גן חיים בעלי חיים 1 ועל מנגנון נפרמים מחלה 2,3, כמו גם עבור מניפולציה המאפיינים של 4 תאים. עם זאת, ההליך הוא מייגע למדי, מאוד זמן רב ויקר, ולכן התאוששות להשתמש בשיטות חלופיות משלוח הגן כגון הזרקת נגיפי 5, הזרקת חדרית היילודים עם electroporation 6 ו ברחם electroporation 7,8. שיטת הזרקה חדרית ללא electroporation הלידה ויש לו קבוצה ייחודית של יתרונות: שימוש שאינו ויראלי בונה גנטיות; אפשרות ליצור דפוס ביטוי מקומי באזור ריבית; ב transfection באתרו של לא נודדות סוגי תאים, כגון קליפת המוח האסטרוציטים.
בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את תהליך מפורט של משלוח גן הלידה למוח החולדה הילוד באמצעות פלסמיד קידוד עבור חלבון משופר פלואורסצנטי ירוק תחת מקדם ביתא אקטין עוף עם CMV משפר (pCAG-EGFP) 9. אנו מדגימים את הכנת פתרון פלסמיד המכיל את הזריקה, ייצור של זכוכית דקה pipettes והרכבה של microinjector על מכשיר stereotactic. אז אנחנו מדברים על anaesthetizing גורים עכברוש עם isoflurane, על ביצוע הניתוח, על הליך ההזרקה ועל electroporation באמצעות מלקחיים אלקטרודות ב porator vivo. לבסוף, אנו נדון בקצרה את התוצאות הצפויות, פרספקטיבות קשיים שעלולים להתעורר במהלך ניסויים אלה.
2. הכנה פלסמיד עבור electroporation
- בדרך כלל אנחנו מכינים 10 μl של הפתרון הזרקת פלסמיד בצינור קיר μl 200 דק. פתרון זה מספיק עבור מספר ניסויים.
- אנו לערבב 8 μl של הפתרון פלסמיד (ראה חומרים וציוד) עם μl 1 של PBS 10X (ראה חומרים וציוד) 1 μl של פתרון מים מהיר 0,1% הירוק (ראו חומרים וציוד).
- הריכוז הסופי של פלסמיד בפתרון הזרקה צריך להיות בין 1 ל 3 מיקרוגרם / μl. ריכוז נמוך של ה-DNA פלסמיד תפחית את יעילות transfection, ואילו ריכוז גבוה DNA תהיה צמיגה מדי הזרקה באמצעות קצה דק של זכוכית נימי.
3. זכוכית הכנה מחט
- להכנת כוס פיפטה, אנו משתמשים זכוכית בורוסיליקט נימי עם נימה (ראה חומרים וציוד) אלקטרודה אנכי זכוכית חולץ (ראה חומרים וציוד) על מקסימום משיכת וחימום פרמטרים.
- לאחר מכן, אנו לשבור את קצה פיפטה בעזרת פיסת נייר כדי להשיג קצה 10-20 מיקרומטר קוטר.
- אנחנו בודקים את קוטר קצה ובצורה אובייקטיבית תחת מיקרוסקופ.
4. Microinjector הרכבת
- שימוש בפולימר דק נימי (ראה חומרים וציוד) אנחנו ממלאים בערך 1 / 3 של נפח של 10 μl המילטון מזרק (ראה חומרים וציוד) עם שמן מינרלי (ראו חומרים וציוד). הימנע בועות אוויר!
- אז אנחנו ממלאים את פיפטה מזכוכית עם שמן מינרלי להכניס את פיפטה לתוך המזרק המילטון. הימנע בועות אוויר!
- מזרק עם כוס פיפטה קבוע אז על microinjector המחוברים לבקר (ראה חומרים וציוד).
- ההתקנה microinjection קבוע על מכשיר stereotactic (ראה חומרים וציוד) מאפשר לנו בבטחה לטבול את קצה פיפטה זכוכית לתוך הצינור עם פתרון הזרקת פלסמיד.
- כאשר קצה נוגע במשטח של הפתרון, לטבול אותו עוד יותר על ידי מ"מ 1 או 2 ולמלא את פיפטה עם μl כ 1 של תמהיל הזרקה באמצעות מזרק מיקרו בקר.
5. Anaesthetizing בעלי חיים
כל הנהלים המוצגים כאן נעשו על פי מאוניברסיטת הלסינקי תקנות ניסויים בבעלי חיים.
- עבור כל ניסוי, אנחנו ממלאים מזרק גז הדוק (ראו חומרים וציוד) עם כ 2 מ"ל של isoflurane (ראה חומרים וציוד).
- מאשר את המזרק הוא קבוע על יחידת ההרדמה (ראה חומרים וציוד) המחובר למקור זרימת אוויר, תיבת חיות את המסכה קבוע על ההתקנה stereotactic.
- על יחידת ההרדמה, אנו להתאים את זרימת האוויר כ 250 מ"ל / דקה ורמת isoflurane ל -4%.
- אנחנו שמים את החולדה הגור לתוך תיבת חיה עבור 2-5 דקות.
- כאשר הגור מפסיק לנוע, למקם אותו על כרית חימום (ראה חומרים וציוד) מצורף ההתקנה stereotactic.
- המקום חלק מקורי של ראשו של הגור לתוך המסכה anaesthetizing.
- זה לוקח 5 עד 10 דקות עבורהגור להיכנס הרדמה עמוקה.
- בדוק את עומק ההרדמה עם קמצוץ הזנב להקטין את יבוא isoflurane ל% כ 1.5-2.0.
6. , כירורגיה Microinjection ו electroporation
- פנקו את העור על ראשו של הגור עם אתנול 70%.
- בעזרת מספריים קטנים (ראה חומרים וציוד) מלקחיים דק (ראה חומרים וציוד), לחתוך את העור בעורפו של הגור אל המצח שלה.
- בנד חתיכות העור לצדדים ולמשוך ברים האוזן מעט לתוך פתחי שמיעתי של הגולגולת על הראש קיבעון העור.
- באמצעות מיקרוסקופ המשקפת, אנחנו לאתר את נקודת גבחת על הגולגולת.
- זהה את האזור של עניין באמצעות קואורדינטות stereotactic.
- מקם את פיפטה זריקה מעל האזור הזה ולסמן אותו על ידי הטלת 25-50 nl הפתרון הזרקה אל פני הגולגולת.
- מקדחה הגולגולת בעדינות ובזהירות בנקודה המסומנת באמצעות מקדחה במהירות גבוהה כירורגי (ראו חומרים וציוד) תחת המיקרוסקופ עד נוזלי מופיע באזור קדח.
- תקן מלקחיים electropotation אלקטרודות (ראה חומרים וציוד) בצידי הגולגולת עם ג'ל מוליך זרם (ראו חומרים וציוד) כדי להשיג מוליכות טובה יותר.
- הסר את טיפת נוזל מהחור קדח בעזרת טמפון קטן (ראה חומרים וציוד) לטבול את המחט זכוכית אל החור על פי הקואורדינטות של הזריקה.
- להשרות 25-100 nl הפתרון הזרקת בשיעור של 5 עד 20 nl / sec.
- במהירות להסיר את פיפטה ו electroporate מיד. Electroporation נעשית על ידי יישום בחמש לחיצות מלבן עם משך של 50 אלפיות ו משרעת של V 99 בתדר של 1 הרץ.
- הסר אלקטרודות וברים האוזן.
- לתפור את העור חתך באמצעות שילוב של מלקחיים אילמת (ראה חומרים וציוד) וחד הנושאים כירורגי (ראו חומרים וציוד).
- הנח את הגור לתוך תא חם 15-30 דקות כדי לסייע להחלמה שלו לאחר הרדמה.
- לאחר מכן החזיר את הגור לכלוב של אמא שלו.
7. נציג תוצאות
הביטוי של transgene בתאי transfected בהצלחה יופיעו כ -10 שעות לאחר electroporation, והוא יישאר יציב במשך כמה שבועות.
אנו microinjected הפלסמיד גם לשכבות עמוקות או קליפת המוח באזור הסטריאטום של יום הלידה 2 (P2) גורים Wistar חולדה שבוצעו electroporation vivo כמתואר לעיל. פרוסות המוח (400 מיקרומטר עובי) נחתכו לאחר 2-6 ימים (P4-P8) באמצעות vibrotome במדיום חיתוך קר (Hepes שנאגרו תמיסת מלח מאוזן של ארל) 10. הרכישה בוצעה באמצעות תמונה Zeiss Axioplan 2 LSM5 פסקל confocal מיקרוסקופ (Zeiss, גרמניה) במדיום חיתוך בטמפרטורת החדר.
אתרי הזרקה בשכבות קורטיקליים עמוקים בסטריאטום הכיל תאים transfected רבים להביע EGFP שאותרו באזור קומפקטית של כ 200-300 מיקרומטר קוטר (איור 1 א ', ב). בתוך תאים transfected, רמת הביטוי EGFP גבוהה מספיק כדי לאפשר הדמיה של תהליכים תאיים דק (איור 1C) כולל דנדריטים עם הקוצים של צורות שונות (איור 1D) וצרורות האקסון (איור 1E). היציבות החזקה של EGFP וכן כדאיות התא לאחר electroporation מותר התחקות החלקים המרוחקים של אקסונים (עד 1.5-2 מ"מ מגופים התא) כגון מסופים קליפת המוח (איור 1F).
באיור 1. (א) transfected בהצלחה תאים באזור הסטריאטום במוח חולדה P4 המגדירה את האתר הזרקת פלסמיד. (ב) תאים transfected בשכבות עמוקות בקליפת המוח (כ 1000 מיקרומטר מתחת לפני השטח קליפת המוח) של המוח עכברוש P5. (ג) תא transfected באזור הסטריאטום במוח חולדה P8. (D) תהליכים דנדריטים של תא transfected באזור הסטריאטום במוח חולדה P8; החצים מצביעים על סוגים שונים של הקוצים הדנדריטים וגם filopodia. (ה) האקסונים של תאים transfected בתוך מסלול בטחונות. (F) האקסונים סיום על פני השטח של pial P8 עכברוש הקורטקס (ראש חץ). ברים הם סולם 100 מיקרומטר על A, B, E ו-F, 10 מיקרומטר על C ו-D
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דרכי המסירה הגן לתוך המוח מכרסם החי מבוססים היטב עבור ברחם electroporation 7,8,11,12, ולאחרונה, עבור electroporation הלידה 6. עם זאת, שיטות אלו מבוססות על הזרקה תוך חדרי של ה-DNA פלסמיד, שיכולה להיות המגביל את מספר יישומים. לדוגמה, שיטות אלו אינן מאפשרות מיקוד תאים באזורים מסוימים במוח כמו ההיפוקמפוס, ולא transfection שאינם נודדים סוגי תאים כאלה האסטרוציטים כמו קליפת המוח. Non-חדרית זריקה בשילוב עם electroporation שימש לראשונה למסירה גן נוירונים לתוך המוח הקטן 13. פרוטוקול שלנו ממחישה את הרחבה של שיטה שאינה חדרית עבור אזורים אחרים במוח חולדה. אנו מציעים גישה מתודולוגית שלנו היא אלטרנטיבה יעילה שיטות ויראלי המסירה הגן לאזורים מוגבלים של עניין בתוך מוח החולדה הלידה 5.
למרות היתרונות של השיטה הנוכחית, קשיים מסוימים עשויים להיות צפויים כפי שנדון בהמשך.
גיל 1.Optimal של חיה
כאשר הדבר אפשרי, גורים צעירים עכברוש בילוד יש להשתמש, כאמצעי להגדיל הן יעילות transfection והישרדות הגור לאחר הניתוח. בידיים שלנו, P0 גורים קטנים מדי כמו שקשה למקד reproducibly אזור מסוים במוח באמצעות קואורדינטות stereotactic המתקבלים אטלס המוח זמין גיל 14 זה. בנוסף, P0 גורים יש עור דק ועדין שעלול לעכב תפירה. P3 ו-P4 נוח ביותר מבחינת מניפולציות כירורגית stereotactic לעומת P0-P2 בעלי חיים, אבל יש להם רגישות יתר isoflurane הרדמה שעלולים לגרום להתקפים והפרעות נשימה במהלך הניתוח. לכן, האפשרות הטובה ביותר היא P1-P2 גורי חולדה אשר צפויים במהלך ניתוח גדול מספיק עבור microinjections לשחזור.
בעיות עם 2.Possible microinjection
כאשר כמויות קטנות של פתרון (25-100 nl) מוזרקים באמצעות טיפ זכוכית דקה לרקמת המוח מפעיל לחצים מנוגדים, זה קריטי, כי בועות אוויר או דליפות נמנעים בקפידה. כדי למנוע אי אלו עלול לגרום לירידה דרמטית יעילות transfection.
3.Precision גבולות קואורדינטות stereotactic
למרות הדיוק של הקואורדינטות stereotactic, יש להם מגבלה על שחזור 0.3 מ"מ 15. מניסיוננו באמצעות בעלי חיים גיל משקל זהה ניתן להקטין את גבול 0.2-0.1 מ"מ אשר מספקת מיקוד לשחזור של אזור CA1 בהיפוקמפוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים יקטרינה Karelina לעזרה עם הקלטת פסקול וידאו, איוון Molotkov עבור 3D אנימציה ד"ר פיטר Blaesse להכנת החטיבה-EGFP פלסמיד.
העבודה נתמכה על ידי מענקים ממרכז הניידות של הבינלאומי של פינלנד, קרן התרבות הפינית האקדמיה של פינלנד.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | equipment | XYtronic | XY-2A-SA | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | equipment | Supertech | TMP-5b | |
| Borosilicate tube with filament | material | Sutter Instrument Co. | BF120-69-10 | Glass needle |
| Disposable drills | material | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | reagent | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | equipment | Fine Science Tools | 91150-20 | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Ealing micr–lectrode puller | equipment | Ealing | 50-2013 | Vertical electrode glass puller |
| Ethilon monofil polyamide 6-0 FS-3 16 mm 3/8c | material | Johnson & Johnson | EH7177H | Surgical threads |
| Exmire micro syringe 10.0 ml | equipment | Exmire | MS*GLLX00 | Gas-tight syringe |
| Fast Green | reagent | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Forceps electrodes | equipment | BEX | LF650P3 | Treat with 70% ethanol for disinfection prior to use |
| Foredom drill control | equipment | Foredom | FM3545 | Surgical drill power supply and control. Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom) |
| Foredom micro motor handpiece | equipment | Foredom | MH-145 | Currently available analogue is micromotor kit K.1070 (Foredom) |
| Gas anesthesia platform for mice | equipment | Stoelting Co. | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Isoflurane | reagent | Baxter Internationl Inc. | FDG9623 | |
| Micro dressing forceps, 105 mm | equipment | Aesculap | BD302R | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Microfil | material | World Precision Instruments, Inc. | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | reagent | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | equipment | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL | Hamilton syringe |
| plasmid CAG-EGFP | reagent | Extracted and purified with EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) and dissolved in nuclease free water to concentration 1.5 mg/ml | ||
| Pulse generator CUY21Vivo-SQ | equipment | BEX | CUY21Vivo-SQ | |
| Schiller electrode gel | reagent | Schiller AG | 2.158000 | Conductive gel |
| Small animal stereotaxic instrument | equipment | David Kopf Instruments | 900 | |
| St–lting mouse and neonatal rat adaptor | equipment | Stoelting Co. | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument.Treat earbars with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | equipment | Fine Science Tools | 91460-11 | Treat with 70% ethanol for disinfection before use in surgical manipulations |
| Sugi absorbent swabs 17 x 8 mm | material | Kettenbach | 31602 | Surgical tampons |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | equipment | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Univentor 400 Anesthesia Unit | equipment | Univentor | 8323001 |
References
- Gerlai, R., Clayton, N. S. Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci. 22, 47-51 (1999).
- McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. A decade of modeling Alzheimer's disease in transgenic mice. Trends Genet. 2, 281-289 (2006).
- Cryan, J. F., Holmes, A. The ascent of mouse: advances in modeling human depression and anxiety. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 775-790 (2005).
- Wells, T., Carter, D. A. Genetic engineering of neural function in transgenic rodents: towards a comprehensive strategy. J. Neurosci. Methods. 108, 111-130 (2001).
- Pilpel, N. reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J. Neurosci. Methods. 182, 55-63 (2009).
- Boutin, C. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3, e1883-e1883 (2008).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101, 16-22 (2004).
- De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
- Walantus, W. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. , (2007).
- Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 16182-16187 (2007).
- Ashwell, K., Paxinos, G. Atlas of the Developing Rat Nervous System. , 3rd edition, Academic Press. (2008).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 6th edition, Academic Press. (2007).
