Summary
هذا الفيديو يدل على التهديف والحث السريرية للنموذج حيواني لمرض التصلب المتعدد : التهاب الدماغ و النخاع المزمن الراجعة الذاتية التجريبية في الفئران DA. المرض الناجم عن تحصين الفئران مع مستحلب كلها تحتوي على النخاع الشوكي والفئران مساعد فرويند الكامل ، ويعرض علامات سريرية تشبه مرض الإنسان.
Abstract
التصلب المتعدد (MS) هو مرض التهابي مزمن للجهاز العصبي المركزي (CNS) الذي يصيب عادة صغار البالغين. يتميز إزالة الميالين واخافة الدبقية في مجالات نشر في الدماغ والحبل الشوكي. هذه الآفات يغير التوصيل العصبي والتسبب في العجز تعطيل العصبية التي تختلف مع مكان لويحات عديمة الميلين في الجهاز العصبي المركزي (مثل خزل سفلي ، والشلل ، والعمى ، وسلس البول).
التهاب الدماغ و النخاع الذاتية التجريبية (EAE) هو نموذج لمرض التصلب العصبي المتعدد. وكان المستحث first EAE بطريق الخطأ في البشر خلال التطعيم ضد داء الكلب ، وذلك باستخدام الفيروسات تزرع في النخاع الشوكي الأرانب. بفعل مخلفات حقن العمود الفقري مع الفيروس المعطل المرض الجهاز العصبي المركزي. بعد هذه الملاحظات ، وقد وصفت نموذج الأول من EAE في الرئيسيات غير البشرية تحصين مع CNS جناسة بواسطة الأنهار وSchwenther في عام 1935. EAE منذ ذلك الحين تم إنشاؤها في مجموعة متنوعة من الأنواع ، ويمكن متابعة دورات مختلفة اعتمادا على الأنواع / السلالة ، وتحصين مستضد المستخدمة. على سبيل المثال ، وتحصين الفئران لويس مع بروتين النخاعين الأساسي في مستحلب مع مساعد يدفع نموذجا EAE الحادة ، في حين أن نفس المستضد يؤدي الى مرض مزمن في الخنازير الغينية.
هي التي يسببها هذا النموذج EAE صفها هنا من قبل تحصين الفئران ضد DA الحبل الشوكي في الفئران DA مستحلب في مساعد فرويند الكامل ل. الفئران وضع الشلل الرخو تصاعدي داخل 7-14 أيام بعد التطعيم. العلامات السريرية متابعة دورة منتكس تحويل أكثر من عدة أسابيع. الباثولوجيا المناعية يظهر تتسرب كبيرة في الجهاز العصبي المركزي واللوحات إزالة الميالين. موصوفة اعتبارات خاصة لرعاية الحيوانات مع EAE في نهاية الفيديو.
Protocol
استقراء ورصد EAE - المزمن الناكس
المستحلب هو مزيج 01:01 من المستضد في محلول مائي إضافة إلى استكمال مساعد فرويند الكامل. من المهم جدا لإضافة المستضد إلى مساعد وليس العكس!
هناك الكثير من النفايات وعندما تقدم عن طريق الحقن مستحلب. تعد دائما 1.5 أو 2 مرات أكثر مما تحتاج إليه.
استخدام الهاون تعقيمها ، مدقة ، والمحاقن والزجاج ، والجسور. وينبغي أن تكون جميع المواد البلاستيكية العقيمة. ويمكن أن يتم إعداد على مقعد المختبرات العادية.
1. إعداد المواد المساعدة تستكمل
تزن 30 ملغ من السل المتفطرة (Difco كتالوج # 231141) والمكان الى الهاون. تحويله إلى مسحوق رقيقة دون ضغط من الصعب جدا لتجنب كسر البكتيريا. إضافة 10 مل من اكتمال مساند فرويند H37Ra (Difco كتالوج # 231131) ومزيج. هذا المساعد تستكمل الآن يحتوي على 4 السل المتفطرة ملغ / مل. نقل إلى الأنبوب.
2. إعداد جناسة الحبل الشوكي
جمع النخاع الشوكي من الفئران DA (العمر / الجنس غير مبال) وتخزينها في المجمد -80 درجة مئوية. وزن الحبال المجمدة الشوكي لديهم ما يكفي لخلط 1:1 (الوزن : حجم) مع مساعد تستكمل. اللحم المفروم والنخاع الشوكي وغرامة ممكن بشفرة الحلاقة ، ونقل إلى هاون استخدمت في الباب 1 ، وجعل عجينة مع مدقة.
3. إعداد مستحلب
- تستكمل مكان كاملة مساعد فرويند في أنبوب. الدوامة بسرعة عالية. إضافة قطرة الحبل الشوكي جناسة قطرة بينما vortexing. عندما يتم إضافة كافة جناسة النخاع الشوكي ، ودوامة لمدة 5 دقائق إضافية. وينبغي أن يتحول الخليط وردي فاتح.
- وضع مستحلب في حقنة 5 مل الزجاج وربطه إلى آخر حقنة 5 مل الزجاج باستخدام جسر 18G (فيشر كتالوج # 14-825 - 17L). إرسال مستحلب من حقنة لأخرى حتى يصبح من الصعب (5-10 دقيقة). إذا كان مستعدا أكثر من 5 مل من مستحلب ، واستخدام المحاقن عدة مل 5 لا تستخدم المحاقن أكبر.
- ويمكن تخزين مستحلب في الحقن في 4 درجة مئوية لمدة 3 أسابيع. أوصي إعداد ما لا يقل عن 12 ساعة في وقت مبكر للتأكد من أنها لا تنهار. وينبغي أن يظل سميكة وغير منفصلة في 2 مراحل. وبين عشية وضحاها تغير اللون إلى الضوء الأصفر أو البيج.
4. تحصين الفئران
- مزيج مستحلب في المحاقن لبضع دقائق ونقلها إلى الحقنة المستخدمة في الحقن. حقن تحت الجلد 200 ميكرولتر في قاعدة جدا من الذيل باستخدام إبر المحاقن 23G و 3 مل Luer لوك تحت التخدير على المدى القصير.
- المستلمين هي 7-9 أسابيع من العمر إناث الفئران DA. نحصل على الفئران لدينا من هارلان ، سبراغ داولي.
- ينبغي التقيد الجرذان مرتين يوميا وزنه يوميا. ومن المتوقع أن العلامات السريرية 7-15 أيام بعد الحقن من مستحلب.
سجل السريرية :
0 : عدم وجود مرض
0.5 : الذيل يعرج القاصي
1 : الذيل يعرج
2 : خزل سفلي خفيفة ، ترنح
3 : خزل سفلي المعتدلة ، ورحلات الفئران من وقت لآخر
3.5 : مشلولة أحد أطرافه الخلفية ، وغيرها من التحركات
4 : شلل تام أطرافهم هند
5 : شلل تام أطرافه الخلفية وسلس
6 : المحتضرة صعوبة في التنفس ، لا تأكل أو تشرب. الموت ببطء على الفور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك بعض الاعتبارات الهامة لهذا البروتوكول.
وعلم الوراثة من الفئران DA تختلف قليلا اعتمادا على مربي واشتروا منه. قد تكون هذه الاختلافات زيادة أو نقصان حساسية الفئران لEAE التعريفي. إذا كان لديك الفئران هم أكثر عرضة للEAE هل تريد أن تقلل من قوة التحصين باستخدام غير كاملة تستكمل مساند فرويند أو غير مكتملة حتى المواد المساعدة فرويند. يمكنك أن تنظر أيضا في تقليل كمية حقن مستحلب أو تمييع جناسة النخاع الشوكي مع المالحة قبل إعداد مستحلب. إذا كان لديك الفئران لا تضع علامات سريرية للEAE باستخدام كامل القوة تحصين مستحلب التحقق من نظافة مرافق السكن الخاص. سوف الفئران المصابة بالطفيليات مثل (الدبوسية) لم تضع EAE. قد تفكر في السكن الخاص الحيوانات تحت ظروف أكثر نظافة في أقفاص تعقيمها مع مرشح قمم ، ومنحهم بالمال وبالشهرة أيضا يحمض الإعلانية المياه (مرفق بروتوكول لإعداد الماء المحمض).
يجب أن يكون الماء المستحلب في زيت بحيث النفط في معطف مساعد تماما مستضد أضفت قطرة قطرة. أعد مستحلب العكس (النفط في المياه) سوف تصبح سميكة ولكن لن يكون دماغي.
الفئران هي حيوانات ودية إذا أنهم اعتادوا على معالج ، فمن ذلك فكرة جيدة للتعامل معها برفق على أساس يومي قبل حقن مستحلب دماغي. وهذا الحد من التوتر وخطر لدغة.
الحيوانات مع EAE الشديد (درجة 3 أو أكثر) بحاجة إلى رعاية خاصة. لا ينبغي أبدا أن تكون الفئران التقطت من ذيله وإنما من قبل الهيئة. هذا هو أكثر أهمية للحد من التوتر في الحيوانات المريضة. من المهم جدا للتأكد من أن جميع الحيوانات من الوصول إلى الغذاء والماء والغذاء عن طريق وضع الجل حزم في الفراش ، وتوفير أنابيب طويلة sipper على زجاجات المياه. وسوف تستمر EAE الفئران مع الأكل والشرب ، وإذا كان وقف الحيوان الأكل أو الشرب استشارة الطبيب البيطري المعهد الخاص بك أو الموت ببطء الحيوان. يجب فصل الفئران المريضة من الحيوانات السليمة لضمان أنها لا تداس باستمرار ، ولكن تجنب ترك الفئران وحدها لأنها هي حيوانات اجتماعية وحاجة الشركة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CB وKGC والمؤسسين والاستشاريين لشركة Airmid
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Freund’s Adjuvant | Reagent | Fisher Scientific | DF 311-360-5 | Manufactured by Difco |
| Mycobacterium tuberculosis H37Ra | Reagent | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Manufactured by Difco |
| DA rat | Animal | Harlan Laboratories | Females, 7-9 weeks old. | |
| Glass syringes - 5 ml | Tool | Fisher Scientific | 14-823-10 B | |
| Metal bridge - 18G | Tool | Fisher Scientific | 14-825-17L | |
| Luer Lok plastic syringes - 3 ml | Tool | BD Biosciences | 309585 | |
| Needles - 20G 1 1/2 | Tool | Fisher Scientific | 14-826-5C |
