Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Inductie en Klinische Scoring van chronische-Relapsing experimentele autoimmune encefalomyelitis

doi: 10.3791/224 Published: July 4, 2007

Summary

Deze video toont de inductie en de klinische scoren van een diermodel van multiple sclerose: chronisch-recidiverende experimentele auto-immune encephalomyelitis in DA ratten. De ziekte, veroorzaakt door het immuniseren van ratten met een emulsie met hele rat het ruggenmerg en de volledige Freund's adjuvans, presenteert klinische symptomen lijken op de menselijke ziekte.

Abstract

Multiple sclerose (MS) is een chronische ontstekingsziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS) die vaak bij jonge volwassenen. Het wordt gekenmerkt door demyelinisatie en gliale schrikken in gebieden verspreid in de hersenen en het ruggenmerg. Deze letsels veranderen zenuwgeleiding en induceren de invaliderende neurologische tekorten die variëren met de locatie van de gedemyeliniseerde plaques in het centraal zenuwstelsel (bijv. paraparese, verlamming, blindheid, incontinentie).

Experimentele auto-immune encephalomyelitis (EAE) is een model voor MS. EAE werd voor het eerst per ongeluk veroorzaakt bij mensen tijdens de vaccinatie tegen hondsdolheid, met behulp van virussen gekweekt op konijnen ruggenmerg. Resten van spinale geïnjecteerd met het geïnactiveerd virus veroorzaakte het CZS ziekte. Naar aanleiding van deze waarnemingen, was een eerste model van EAE beschreven in de niet-menselijke primaten geïmmuniseerd met een CNS homogenaat door rivieren en Schwenther in 1935. EAE is sindsdien gegenereerd in een variëteit van soorten en kunnen volgen verschillende cursussen afhankelijk van de soort / stam en immuniseren gebruikte antigeen. Bijvoorbeeld, immuniseren Lewis ratten met myeline basisch eiwit in emulsie met adjuvans induceert een acute model van EAE, terwijl dezelfde antigeen veroorzaakt een chronische ziekte bij cavia's.

De EAE-model hier beschreven wordt veroorzaakt door het immuniseren van DA ratten tegen DA rat het ruggenmerg in de emulsie in volledig Freund's adjuvans. Ratten ontwikkelen een oplopende slappe verlamming binnen 7-14 dagen na de immunisatie. Klinische symptomen volgen een relapsing-remitting koers over een aantal weken. Pathologie blijkt uit grote immuun infiltreert in het CZS en demyelinisatie plaques. Speciale overwegingen voor het nemen van de zorg voor dieren met EAE worden beschreven aan het eind van de video.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Inductie en monitoring van chronische recidiverende EAE

De emulsie is een 1:1 mengsel van antigeen in waterige oplossing toegevoegd aan aangevuld met Freund's volledig adjuvans. Het is zeer belangrijk om het antigeen toe te voegen aan de hulpstof en niet andersom!

Er is een veel afval bij het maken van en het injecteren van een emulsie. Altijd bereiden 1,5 of 2 keer meer dan wat je nodig hebt.

Gebruik geautoclaveerd mortier, de stamper, glazen spuiten, en bruggen. Alle kunststoffen moet steriel zijn. Het preparaat kan worden gedaan op een regelmatige laboratoriumtafel.

1. Voorbereiding van de aangevuld met adjuvante

Weeg 30 mg van het Mycobacterium tuberculosis (Difco catalogus # 231141) en plaats deze in een vijzel. Maak in dunne poeder zonder op te hard om te voorkomen dat het breken van de bacteriën. Voeg 10 ml van de volledige Freund's adjuvans H37Ra (Difco catalogus # 231131) en meng. Dit aangevuld met adjuvans bevat nu 4 mg / ml Mycobacterium tuberculosis. Transfer naar een buis.

2. Voorbereiding van het ruggenmerg homogenaat

Verzamel ruggenmerg van DA ratten (leeftijd / geslacht onverschillig) en op te slaan ingevroren bij -80 ° C. Weeg de bevroren ruggenmerg te hebben genoeg aan 1:1 (gewicht: volume) mengen met het aangevulde adjuvans. Hak het ruggenmerg zo fijn mogelijk met een scheermesje, over te dragen aan de mortel worden gebruikt in paragraaf 1, en maken een pasta met de stamper.

3. De voorbereiding van de emulsie

  1. Plaats aangevuld volledig Freund's adjuvans in een buis. Vortex op hoge snelheid. Voeg het ruggenmerg homogenaat druppelsgewijs, terwijl vortexen. Wanneer alle van het ruggenmerg homogenaat wordt toegevoegd, vortex nog 5 minuten. Het mengsel moet draaien licht roze.

  2. Doe de emulsie in een 5 ml glazen injectiespuit en een link naar een andere 5 ml glazen injectiespuit met behulp van een 18G brug (Fisher catalogus # 14 tot 825-17L). Stuur de emulsie uit een spuit naar de andere totdat het wordt moeilijk (5-10 min). Als er meer dan 5 ml van de emulsie wordt bereid, gebruik maken van verschillende 5 ml spuiten NIET groter spuiten gebruiken.

  3. De emulsie kan worden opgeslagen in de spuiten bij 4 ° C gedurende 3 weken. Ik raad te bereiden op ten minste 12 uur van tevoren om te controleren dat het niet breken. Het moet blijven dik en niet gescheiden in 2 fasen. De kleur zal 's nachts veranderen in een licht geel of beige.

4. Immunisatie van de ratten

  1. Meng de emulsie in de spuiten voor een paar minuten en transfer naar de spuit die voor de injectie. Subcutaan injecteren 200 ul aan de basis van de staart met behulp van 23G naalden en 3 ml Luer-Lock spuiten onder de kortlopende anesthesie.

  2. De ontvangers zijn 7-9 weken oude vrouwelijke DA ratten. We krijgen onze ratten van Harlan Sprague-Dawley.

  3. Ratten moeten tweemaal per dag worden geobserveerd en gewogen dagelijks. Klinische symptomen worden verwacht 7-15 dagen na de injectie van de emulsie.

Klinische scoren:

0: geen ziekte

0.5: distale slap tail

1: slap tail

2: milde paraparese, ataxie

3: matig paraparese, de ratten trips van tijd tot tijd

3.5: een achterste ledematen is verlamd, de andere zetten

4: complete achterste ledematen verlamming

5: complete achterste ledematen verlamming en incontinentie

6: stervende, ademhalingsproblemen, niet eten of drinken. Euthanaseren onmiddellijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Er zijn een paar belangrijke overwegingen voor dit protocol.

Genetica van DA ratten zullen enigszins verschillen afhankelijk van welke fokker ze zijn gekocht. Deze verschillen kunnen verhogen of verlagen van de gevoeligheid van ratten inductie EAE. Als je ratten zijn meer vatbaar voor EAE wil je de kracht van de immunisatie te verminderen door het gebruik van niet-aangevuld met volledig Freund's adjuvans of zelfs incompleet Freund's adjuvans. U kunt ook het verminderen van de hoeveelheid emulsie geïnjecteerd of verdunnen van het ruggenmerg homogenaat met een zoutoplossing overwegen voordat de voorbereiding van de emulsie. Als je ratten ontwikkelen geen klinische tekenen van EAE het gebruik van de full-sterkte immuniseren emulsie Controleer de reinheid van uw woning faciliteit. Ratten die besmet zijn met parasieten (zoals pinworm) zal zich niet ontwikkelen EAE. Kunt u overwegen uw woning dieren onder voorwaarden in schoner geautoclaveerd kooien met filter-tops, en hen aangezuurd water ad libitum (het protocol voor het bereiden van aangezuurd water is aangesloten).

De emulsie moet water-in-olie worden, zodat de olie in de adjuvante volledig vacht van het antigeen die u toevoegt druppel voor druppel. Een emulsie bereid andersom (olie-in-water) zal zo dik maar zal niet worden encefalitogene.

Ratten zijn vriendelijke dieren als ze gewend zijn aan hun baas, het is daarom een ​​goed idee om voorzichtig mee om te gaan op een dagelijkse basis voor de injectie van het encefalitogene emulsie. Dit vermindert stress en het risico van een beet.

Dieren met ernstige EAE (score van 3 of meer) hebben speciale zorg nodig. Ratten mogen nooit worden opgepikt door de staart, maar eerder door het lichaam. Dit is nog belangrijker voor het verminderen van stress bij zieke dieren. Het is zeer belangrijk ervoor te zorgen dat alle dieren de toegang tot voedsel en water hebben door er voedsel en gel packs in de bedden en het verstrekken van lange-sipper buizen op het water flessen. Ratten met EAE zullen blijven eten en drinken, als een dier te stoppen of het eten of drinken contact op met uw dierenarts of instituut laten inslapen van het dier. Zieke ratten moeten gescheiden worden van gezonde dieren te zorgen dat ze niet voortdurend vertrapt, maar alleen achter te laten omdat ze ratten zijn sociale dieren en moeten bedrijf.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

CB en KGC zijn mede-oprichters en consultants voor Airmid Inc

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Complete Freund’s Adjuvant Reagent Fisher Scientific DF 311-360-5 Manufactured by Difco
Mycobacterium tuberculosis H37Ra Reagent Fisher Scientific DF3114-33-8 Manufactured by Difco
DA rat Animal Harlan Laboratories Females, 7-9 weeks old.
Glass syringes - 5 ml Tool Fisher Scientific 14-823-10 B
Metal bridge - 18G Tool Fisher Scientific 14-825-17L
Luer Lok plastic syringes - 3 ml Tool BD Biosciences 309585
Needles - 20G 1 1/2 Tool Fisher Scientific 14-826-5C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Inductie en Klinische Scoring van chronische-Relapsing experimentele autoimmune encefalomyelitis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and Clinical Scoring of Chronic-Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (5), e224, doi:10.3791/224 (2007).More

Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and Clinical Scoring of Chronic-Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (5), e224, doi:10.3791/224 (2007).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter