Induction et notation clinique de chronique récurrente encéphalomyélite allergique expérimentale

Summary

Cette vidéo montre le score d'induction et cliniques d'un modèle animal de sclérose en plaques: chronique récurrente encéphalomyélite allergique expérimentale chez des rats DA. La maladie, provoquée par les rats immunisant avec une émulsion contenant la moelle épinière de rats et de toute l'adjuvant complet de Freund, présente des signes cliniques ressemblant à la maladie humaine.

Abstract

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire chronique du système nerveux central (SNC) qui touche généralement les jeunes adultes. Elle se caractérise par une démyélinisation et effrayer gliales dans les zones diffusées dans le cerveau et la moelle épinière. Ces lésions modifient la conduction nerveuse et provoquer des déficits neurologiques invalidantes qui varient avec l'emplacement des plaques démyélinisées dans le SNC (paraparésie par exemple, paralysie, cécité, incontinence).

Auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle pour la SEP. EAE a été induite par accident chez les êtres humains lors de la vaccination contre la rage, en utilisant des virus cultivés sur la moelle épinière de lapin. Les résidus de la colonne vertébrale avec injecté le virus inactivé induit la maladie du SNC. Suite à ces observations, un premier modèle de l'EAE a été décrit dans des primates non humains immunisés avec un homogénat SNC par Rivers et Schwenther en 1935. EAE a depuis été générés dans une variété d'espèces et peut suivre des cours différents en fonction de l'espèce / souche et les immunisant antigène utilisé. Par exemple, en immunisant des rats Lewis avec la protéine de myéline de base dans l'émulsion avec un adjuvant induit un modèle aigu de l'EAE, tandis que le même antigène induit une maladie chronique chez les porcs Guinée.

Le modèle décrit ici est l'EAE induite par la vaccination contre la moelle des rats DA DA épinière du rat en émulsion dans l'adjuvant complet de Freund. Les rats développent une paralysie ascendante flasque dans les 7-14 jours post-vaccination. Les signes cliniques suivent un cours rémittente pendant plusieurs semaines. Pathologie montre de grandes s'infiltre immunitaires dans le SNC et des plaques de démyélinisation. Considérations particulières pour prendre soin des animaux avec l'EAE sont décrits à la fin de la vidéo.

Protocol

L'induction et la surveillance des maladies chroniques récurrente EAE

L'émulsion est un mélange 1:1 de l'antigène en solution aqueuse ajoutée à compléter l'adjuvant complet de Freund. Il est très important d'ajouter l'antigène à l'adjuvant et non l'inverse!

Il ya beaucoup de déchets lors de l'injection et une émulsion. Toujours préparer 1,5 ou 2 fois plus que ce dont vous avez besoin.

Utiliser le mortier autoclavés, pilon, seringues en verre, et les ponts. Tous les plastiques doivent être stériles. La préparation peut être faite sur une paillasse de laboratoire régulières.

1. Préparation de l'adjuvant complété

Peser 30 mg de Mycobacterium tuberculosis (catalogue # 231141 Difco) et mettre dans un mortier. Faire en poudre fine sans appuyer trop fort pour éviter de casser les bactéries. Ajouter 10 ml d'adjuvant complet de Freund H37Ra (Difco catalogue # 231131) et mélanger. Cet adjuvant contient maintenant complété 4 mg / ml de Mycobacterium tuberculosis. Transférer dans un tube.

2. Préparation de l'homogénat de la moelle épinière

Recueillir la moelle épinière des rats de DA (âge / sexe indifférent) et de conserver congelés à -80 ° C. Peser les cordons congelés épinière d'avoir assez pour mélanger 1:1 (poids: volume) avec l'adjuvant complété. Emincez les moelles épinières aussi fine que possible avec une lame de rasoir, le transfert au mortier utilisé dans la section 1, et faire une pâte avec le pilon.

3. Préparation de l'émulsion

1. Placez complété adjuvant complet de Freund dans un tube. Vortex à vitesse élevée. Ajouter la chute de la moelle épinière homogénat à goutte tout en vortex. Lorsque tous les homogénat de la moelle épinière est ajouté, vortex pendant 5 minutes. Le mélange doit tourner rose pâle.
   
   
2. Mettez l'émulsion dans une seringue de 5 ml en verre et le lier à une autre seringue en verre de 5 ml à l'aide d'un pont 18G (catalogue Fisher n ° 14-825-17L). Envoyer l'émulsion d'une seringue à l'autre jusqu'à ce qu'il devienne dur (5-10 min). Si plus de 5 ml d'émulsion est préparée, l'utilisation de plusieurs seringues de 5 ml NE PAS utiliser de plus grandes seringues.
   
   
3. L'émulsion peut être stockée dans les seringues à 4 ° C pendant 3 semaines. Je recommande le préparer au moins 12 heures à l'avance pour vérifier qu'il ne se décompose pas. Il devrait rester épaisse et non séparée en 2 phases. La couleur va changer du jour au lendemain d'une lumière jaune ou beige.

4. L'immunisation des rats

1. Mélanger l'émulsion dans les seringues pendant quelques minutes et le transfert à la seringue utilisée pour l'injection. Injecter 200 pi sous-cutanée à la base même de la queue à l'aide d'aiguilles 23G et 3 ml Luer-Lock seringues sous anesthésie de courte durée.
   
   
2. Les récipiendaires sont 7-9 semaines vieilles femelles rats DA. Nous obtenons nos rats de Harlan-Sprague-Dawley.
   
   
3. Les rats doivent être observées deux fois par jour et pesés quotidiennement. Les signes cliniques sont attendus 7-15 jours après l'injection de l'émulsion.
   

Score clinique:

0: pas de maladie

0.5: la queue distale boite

1: la queue molle

2: paraparésie doux, une ataxie

3: paraparésie modérée, les déplacements des rats de temps en temps

3.5: un des membres postérieurs est paralysé, l'autre se déplace

4: paralysie complète des membres postérieurs

5: paralysie complète des membres postérieurs et de l'incontinence

6: moribonde difficulté à respirer, ne pas manger ni boire. Euthanasier immédiatement.

Discussion

Il ya quelques considérations importantes pour ce protocole.

Génétique de rats DA diffèrent légèrement selon le sélectionneur, ils sont achetés à partir. Ces différences peuvent augmenter ou diminuer la sensibilité des rats à l'EAE induction. Si vos rats sont plus sensibles à l'EAE, vous voulez réduire la force de la vaccination en utilisant non complétées adjuvant complet de Freund ou encore l'adjuvant incomplet de Freund. Vous pouvez également envisager de réduire la quantité d'émulsion injectée ou de dilution de l'homogénat de la moelle épinière avec une solution saline avant de préparer l'émulsion. Si votre rat ne se développent pas de signes cliniques de l'EAE utilisant la pleine puissance immunisant émulsion vérifier la propreté de votre installation de logements. Les rats infectés par des parasites (comme les oxyures) ne se développera pas EAE. Vous pouvez considérer le logement de vos animaux dans des conditions plus propre dans des cages autoclavées avec filtre-tops, et en leur donnant ad libitum eau acidifiée (le protocole pour la préparation de l'eau acidifiée est jointe).

L'émulsion doit être de l'eau dans l'huile pour que l'huile dans le traitement adjuvant enduire complètement l'antigène vous ajoutez goutte à goutte. Une émulsion préparée dans l'autre sens (huile dans eau) va devenir aussi épais mais ne sera pas encéphalitogène.

Les rats sont des animaux amicaux s'ils sont habitués à leur gestionnaire, il est donc une bonne idée de les manipuler délicatement sur une base quotidienne avant l'injection de l'émulsion encéphalitogène. Cela permettra de réduire le stress et le risque d'une morsure.

Animaux avec EAE sévère (score de 3 ou plus) besoin de soins spéciaux. Les rats ne doivent jamais être pris par la queue, mais plutôt par l'organisme. Ceci est encore plus important pour réduire le stress chez les animaux malades. Il est très important de s'assurer que tous les animaux ont accès à la nourriture et l'eau en mettant paquets de nourriture et de gel dans la literie et la fourniture à long sipper tubes sur les bouteilles d'eau. Les rats avec EAE continueront de manger et de boire, si un arrêt des animaux manger ni boire de consulter le vétérinaire de votre institut ou de l'euthanasier l'animal. Rats malades doivent être séparés des animaux sains afin de s'assurer qu'ils ne sont pas constamment bafoués, mais il faut éviter les rats laissant seul car ils sont des animaux sociaux et besoin de compagnie.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s Adjuvant	Reagent	Fisher Scientific	DF 311-360-5	Manufactured by Difco
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	Reagent	Fisher Scientific	DF3114-33-8	Manufactured by Difco
DA rat	Animal	Harlan Laboratories		Females, 7-9 weeks old.
Glass syringes - 5 ml	Tool	Fisher Scientific	14-823-10 B
Metal bridge - 18G	Tool	Fisher Scientific	14-825-17L
Luer Lok plastic syringes - 3 ml	Tool	BD Biosciences	309585
Needles - 20G 1 1/2	Tool	Fisher Scientific	14-826-5C