Induzione e punteggio clinico dell'epatite cronica-recidivante encefalomielite autoimmune sperimentale

Summary

Questo video dimostra il punteggio di induzione e clinica di un modello animale di sclerosi multipla: cronico-recidivante encefalomielite autoimmune sperimentale nei ratti DA. La malattia, indotta da immunizzando topi con una emulsione che contiene tutto midollo spinale di ratto e adiuvante completo di Freund, presenta segni clinici simile alla malattia umana.

Abstract

La sclerosi multipla (SM) è una malattia infiammatoria cronica del sistema nervoso centrale (SNC) che colpisce generalmente i giovani adulti. E 'caratterizzato da demielinizzazione e spaventando gliali nelle aree disseminate nel cervello e nel midollo spinale. Queste lesioni alterano la conduzione nervosa e indurre i deficit neurologici invalidanti che variano con la posizione delle placche demielinizzati nel sistema nervoso centrale (es. paraparesi, paralisi, cecità, incontinenza).

Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello per la SM. EAE è stato indotto accidentalmente negli esseri umani durante la vaccinazione contro la rabbia, con virus coltivati ​​su coniglio midollo spinale. Residui di iniezione spinale con il virus inattivato indotta la malattia SNC. A seguito di queste osservazioni, un primo modello di EAE è stata descritta nel primati non umani immunizzati con un sistema nervoso centrale omogenato da fiumi e Schwenther nel 1935. EAE da allora è stato generato in una varietà di specie e possono seguire corsi diversi a seconda della specie / ceppo e immunizzante antigene utilizzato. Per esempio, immunizzando topi Lewis con proteina basica della mielina in emulsione con adiuvante induce un modello di EAE acuta, mentre lo stesso antigene induce una malattia cronica nelle cavie.

Il modello di EAE qui descritto è indotta da immunizzando topi DA contro il midollo spinale nel ratto DA emulsione in adiuvante completo di Freund. Ratti sviluppare una paralisi flaccida ascendente entro 7-14 giorni post-vaccinazione. Segni clinici seguono una sclerosi multipla recidivante-remittente per diverse settimane. Patologia grandi spettacoli infiltrati immunitario del sistema nervoso centrale e placche demielinizzazione. Considerazioni speciali per prendersi cura di animali con EAE sono descritte alla fine del video.

Protocol

Induzione e monitoraggio delle patologie cronico-recidivante EAE

L'emulsione è una miscela 1:1 di antigene in soluzione acquosa aggiunto integrato adiuvante completo di Freund. E 'molto importante aggiungere l'antigene per l'adiuvante e non viceversa!

Ci sono un sacco di rifiuti quando si effettua l'iniezione e una emulsione. Sempre preparare 1,5 o 2 volte più di quello che vi serve.

Usa mortaio in autoclave, pestello, siringhe di vetro, e ponti. Tutte le plastiche devono essere sterili. La preparazione può essere fatta su un banco di laboratorio regolare.

1. Preparazione del coadiuvante integrato

Pesare 30 mg di Mycobacterium tuberculosis (catalogo Difco # 231141) e posto in un mortaio. Fai in polvere sottile senza premere troppo per evitare di rompere i batteri. Aggiungere 10 ml di adiuvante completo di Freund H37Ra (Difco catalogo # 231131) e mescolare. Questo adiuvante integrato ora contiene 4 mg / ml di Mycobacterium tuberculosis. Trasferire in un tubo.

2. Preparazione del midollo spinale omogenato

Raccogliere midollo spinale di DA ratti (età / sesso indifferente) e conservare congelati a -80 ° C. Pesare i cavi congelato spinale di avere abbastanza da mix 1:1 (peso: volume) con l'adiuvante completati. Tritare il midollo spinale il più finemente possibile con una lama di rasoio, trasferimento in malta utilizzata nella sezione 1, e fare una pasta con il pestello.

3. Preparazione della emulsione

1. Luogo integrato adiuvante completo di Freund in un tubo. Vortice ad alta velocità. Aggiungere il calo del midollo spinale omogenato a goccia, mentre vortex. Quando tutti i omogenato midollo spinale è aggiunto, vortex per 5 minuti. La miscela dovrebbe diventare rosa chiaro.
   
   
2. Mettere l'emulsione in una siringa da 5 ml in vetro e collegarlo ad un altro siringa di vetro da 5 ml con un ponte di 18G (catalogo Fisher # 14-825-17L). Invia l'emulsione da una siringa all'altra fino a quando diventa difficile (5-10 minuti). Se più di 5 ml di emulsione è preparato, utilizzare diversi ml 5 siringhe NON usare più grandi siringhe.
   
   
3. L'emulsione può essere memorizzato in siringhe a 4 ° C per 3 settimane. Raccomando prepararla almeno 12 ore in anticipo per verificare che non si rompe. Dovrebbe rimanere spessa e non separati in 2 fasi. Il colore cambia durante la notte per una luce gialla o beige.

4. Immunizzazione dei topi

1. Mescolare l'emulsione nelle siringhe per qualche minuto e il trasferimento alla siringa usata per l'iniezione. Iniettare 200 ul per via sottocutanea alla base stessa della coda con aghi 23G e 3 ml siringhe Luer-Lock in breve anestesia.
   
   
2. I destinatari sono 7-9 settimane di età ratti femmina DA. Riceviamo dal nostro Harlan ratti Sprague-Dawley.
   
   
3. I ratti devono essere osservati due volte al giorno e pesati tutti i giorni. I segni clinici sono attesi 7-15 giorni dopo l'iniezione di emulsione.
   

Punteggio clinico:

0: nessuna malattia

0.5: distale coda zoppicare

1: coda zoppicare

2: paraparesi mite, atassia

3: paraparesi moderato, i viaggi ratti di volta in volta

3.5: un arto posteriore è paralizzato, l'altra si muove

4: completa paralisi degli arti posteriori

5: completa paralisi degli arti posteriori e incontinenza

6: moribondo, difficoltà a respirare, non mangiare o bere. Eutanasia immediatamente.

Discussion

Ci sono alcune considerazioni importanti per questo protocollo.

La genetica dei topi DA varierà leggermente a seconda di quale allevatore sono acquistato. Queste differenze possono aumentare o diminuire la suscettibilità dei topi EAE a induzione. Se il vostro ratti sono più suscettibili alle EAE si vuole ridurre la forza della vaccinazione utilizzando non integrato completo di Freund adiuvante o adiuvante incompleto di Freund. È anche possibile ridurre la quantità di emulsione iniettati o diluire l'omogeneizzato midollo spinale con soluzione fisiologica prima di preparare l'emulsione. Se il vostro topi non sviluppano i segni clinici della EAE utilizzando la piena forza immunizzando emulsione controllare la pulizia della struttura alloggiativa. Topi infettati da parassiti (come ossiuri) non si svilupperà EAE. Si può considerare abitazioni tuoi animali in condizioni di pulizia in gabbie in autoclave con filtro-top, e dando loro l'acqua acidificata ad libitum (il protocollo per la preparazione di acqua acidificata è allegato).

L'emulsione deve essere acqua in olio in modo che l'olio in mano completamente l'adiuvante l'antigene si aggiunge goccia a goccia. Un'emulsione preparata viceversa (olio in acqua) diventerà come spesso, ma non sarà encephalitogenic.

I ratti sono animali amichevoli se sono abituati a loro gestore, è quindi una buona idea per gestire con delicatezza su una base quotidiana prima dell'iniezione di emulsione encephalitogenic. Ciò consentirà di ridurre lo stress e il rischio di un morso.

Animali con EAE grave (punteggio di 3 o più) bisogno di cure particolari. I ratti non dovrebbe mai essere preso per la coda, ma piuttosto dal corpo. Questo è ancora più importante per ridurre lo stress negli animali malati. E 'molto importante assicurarsi che tutti gli animali hanno accesso a cibo ed acqua, mettendo confezioni alimentari e gel nella biancheria da letto e fornendo a lungo sipper tubi sulle bottiglie d'acqua. Ratti con EAE continuerà a mangiare e bere, se un animale sia smettere di mangiare o bere consultare il veterinario del vostro Istituto o eutanasia degli animali. Ratti malati devono essere separati da animali sani, per verificare che non siano costantemente calpestati, ma evitare i ratti di lasciare da soli dal momento che sono animali sociali e hanno bisogno di compagnia.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s Adjuvant	Reagent	Fisher Scientific	DF 311-360-5	Manufactured by Difco
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	Reagent	Fisher Scientific	DF3114-33-8	Manufactured by Difco
DA rat	Animal	Harlan Laboratories		Females, 7-9 weeks old.
Glass syringes - 5 ml	Tool	Fisher Scientific	14-823-10 B
Metal bridge - 18G	Tool	Fisher Scientific	14-825-17L
Luer Lok plastic syringes - 3 ml	Tool	BD Biosciences	309585
Needles - 20G 1 1/2	Tool	Fisher Scientific	14-826-5C