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Biology

유도 및 만성 - 원래대로 돌아가는 실험 면역 Encephalomyelitis 임상 채점

doi: 10.3791/224 Published: July 4, 2007

Summary

DA 쥐에서 만성 - 원래대로 돌아가는 실험 면역 encephalomyelitis :이 비디오는 여러 경화증의 동물 모델의 유도 및 임상 채점을 보여줍니다. 전체 쥐의 척수하고 완전한 프로 인드의 도움이되는가 포함된 유제와 immunizing 쥐가 유도된 질병은, 인간의 질병을 닮은 임상 징후를 보여줍니다.

Abstract

다중 경화증 (MS)는 일반적으로 젊은 성인에 영향을 미치는 중추 신경계 (CNS)의 만성 염증성 질환입니다. 이것은 두뇌 및 척수에 전파 영역에서 demyelination과 glial 무섭게이 특징입니다. 이러한 병변은 신경 전도를 변경하고 CNS (예 : paraparesis, 마비, 실명, 실금)에 demyelinated plaques의 위치와 다릅니다 해제 신경 적자를 유발.

실험 면역 encephalomyelitis (EAE)은 MS의 모델입니다. EAE 먼저 토끼 척수 코드에서 성장 바이러스를 사용하여, 광견병 예방 접종 기간 동안 인간의 실수로 유도했다. inactivated 바이러스에 주입 척수의 잔류물은 CNS 질환을 유도. 이러한 관찰 다음, EAE의 첫 번째 모델은 하천에 의해 homogenate 및 1935 년에 Schwenther CNS와 함께 예방 접종을하지 않은 인간 영장류에서 설명했습니다. EAE 이후 인류의 다양한 생성되었고 종 / 변형에 따라 그리고 항원이 사용 immunizing 다른 과정을 따를 수 있습니다. 동일한 항원은 실험용 돼지의 만성 질병을 유도하면서 예를 들어, 도움이되는와 유제에서 기본적인 myelin 단백질과 루이스 쥐나 immunizing 것은 EAE의 급성 모델을 유도.

EAE 모델 여기에 설명된 내용은 전체 프로 인드의 도움이되는에있는 유제의 DA 랫 척수에 대한 검찰의 쥐가 immunizing에 의해 유도됩니다. 쥐들이 7~14일 사후 예방 접종 이내 오름차순 이완된 마비를 개발할 수 있습니다. 임상 증상은 몇 주 동안 원래대로 돌아가는 - remitting 과정을 따르십시오. 병리학은 CNS와 demyelination의 plaques 큰 면역 infiltrates를 보여줍니다. EAE과 동물 돌보기위한 특별 고려 사항은 비디오의 끝부분에 설명되어 있습니다.

Protocol

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만성 - 원래대로 돌아가는 EAE의 유도 및 모니터링

유제는 보충 완료 인드의 도움이되는 추가 수용액에서 항원의 1:1 혼합물이다. 그것은 도움이되는가 아닌 다른 방법으로 라운드에 항원을 추가하는 것이 매우 중요합니다!

결정과 유제를 주입하면 폐기물의 많은있다. 항상 1.5 또는 2 배에게 필요한 것 이상을 준비.

autoclaved 박격포, 유봉, 유리 주사기, 그리고 다리를 사용하십시오. 모든 플라스틱은 멸균되어야합니다. 준비는 정기적으로 실험실 벤치에서 할 수 있습니다.

1. 보충 도움이되는의 준비

Mycobacterium 결핵 (Difco 카탈로그 # 231141)와 절구에 장소 30 MG 나가는거야. 세균을 깨는 피하기 위해 너무 열심히 누르지 않고 얇은 가루로합니다. 프로 인드의 도움이되는 H37Ra (Difco 카탈로그 # 231131)와 혼합을 완료 10 ML을 추가합니다. 이 보충 도움이되는 지금은 4 MG / ML Mycobacterium의 결핵이 포함되어 있습니다. 튜브로 전송합니다.

2. 척수의 homogenate의 준비

-80에서 냉동 DA 쥐 (연령 / 성별 무관) 및 저장 ° C.에서 척추 코드를 수집 보충 도움이되는과 : 1시 1분를 (볼륨 무게) 혼합 충분해야 냉동 척추 코드를 달다. 면도날로 가능한 벌금으로 척추 코드를 말하다, 제 1에서 사용되는 박격포로 전송하고, 유봉와 붙여넣기를합니다.

3. 유제의 준비

  1. 장소는 튜브에 프로 인드의 도움이되는을 완료 보충. 고속으로 소용돌이. vortexing 동안 드롭하여 척수 homogenate 드롭을 추가합니다. 5 분 더 척수의 homogenate의 모든 추가, 소용돌이. 혼합물은 밝은 분홍색으로 설정해야합니다.

  2. 5 ML 유리 주사기에 감광 유제를 넣고 (피셔 카탈로그 # 14-825 - 17L) 18G 다리를 사용하여 다른 5 ML 유리 주사기에 연결합니다. 그것이 (5-10 분) 하드된다 때까지 다른 주사기에서 유제를 보내드립니다. 유제 5 개 이상 ML이 준비되면, 몇 가지 5 ML의 주사기는 큰 주사기를 사용하지 마십시오 사용합니다.

  3. 유제는 3 주 동안 4 ° C에서 주사기에 저장할 수 있습니다. 나는 그것이 분해되지 있는지 확인하기 위해 사전에 적어도 12 시간 준비하는 것이 좋습니다. 그것은 두께 2 단계에서 별도의 안 유지됩니다. 색상은 노란색이나 베이지색이 빛을 하룻밤 변경됩니다.

4. 쥐를 예방 접종

  1. 몇 분 동안 주사기에 감광 유제를 혼용하여 주사에 사용되는 주사기로 전송할 수 있습니다. 단기 마취 23G 바늘 3 ML Luer - 잠금 주사기를 사용하여 꼬리의 아주 기본에 subcutaneously 200 μl를 주입.

  2. 수신자가 7~9주 오래된 여성 DA의 쥐입니다. 우리는 할런 - 스프 라그 돌리에서 우리 쥐를 얻을.

  3. 쥐 두 번 매일 매일 관찰하고 무게가 있어야합니다. 임상 증상은 7-15일 유제의 주입 후 예상된다.

임상 채점 :

0 : 없음 질환

0.5 : 말초 미약 꼬리

1 : 미약 꼬리

2 : 가벼운 paraparesis, 운동 실조증

3 : 중간 paraparesis, 수시로 쥐 여행

3.5 : 한 뒷다리가 마비되어 다른 이동

4 : 전체 뒷다리 사지 마비

5 : 완전한 뒷다리 사지 마비 및 실금

6 : 죽어가는, 어려움 호흡은 먹지도 않고 마시지도 않습니다. 즉시 안락사.

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Discussion

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이 프로토콜에 대한 몇 가지 중요한 고려 사항이 있습니다.

DA의 쥐의 유전자들은로부터 구입하는 종족에 따라 약간 다를 수 있습니다. 이러한 차이는 유도를 EAE하는 쥐의 자화율를 증가 또는 감소됩니다. 당신의 쥐가 EAE에 더 민감한 경우가 아닌 보완 완료 인드의 도움이되는 또는 불완전한 프로 인드의 도움이되는을 사용하여 예방 접종의 강도를 줄이는 것이 좋습니다. 당신은 또한 유제를 준비하기 전에 주입 유제의 양을 감소하거나 생리와 척수의 homogenate를 diluting 고려할 수 있습니다. 당신의 쥐들이 유제가 주택 시설의 청결을 확인 immunizing 전체 강도를 사용 EAE의 임상 증상을 개발하지 않으면. 기생충 (예 : pinworm 등)에 감염된 쥐 EAE를 개발하지 않습니다. 이 필터 - 정상과 autoclaved 새장에 청소기 조건 아래 동물 주택, 그리고 그들에게 산성 물 광고 libitum (산성 물을 준비에 대한 프로토콜이 첨부되어 있습니다)를주는 것이 좋습니다.

유제는 물 - 인 - 오일되어야합니다 있도록 도움이되는에있는 기름이 완전히 코팅이 드롭 들러 추가 항원합니다. 유제는 다른 방식 라운드 (오일 - 인 - 물) 두께로 될 것입니다 준비하지만 encephalitogenic되지 않습니다.

쥐 친절 동물들은 자신의 핸들러에 익숙한 경우, 따라서 encephalitogenic 유제의 주입 전에 매일 부드럽게 그들을 처리하는 것이 좋습니다. 이것은 스트레스와 무는의 위험을 줄일 수 있습니다.

심각한 EAE (3 이상의 점수)와 동물 특별한주의가 필요합니다. 쥐는 꼬리가 아니라 신체의 고른해서는 안됩니다. 이것은 더 중요한 아픈 동물의 스트레스를 줄이기위한 것입니다. 그것은 모든 동물 침구 음식과 젤 팩을 퍼팅과 물 병에 장기 sipper 튜브를 제공함으로써 식품 및 물에 액세스할 수 있도록 매우 중요합니다. EAE와 쥐는 동물 중지 중 식사 또는 연구소의 수의사를 참조 마시면, 먹고 마시는 계속하거나 동물을 안락사시켜야합니다. 아픈 쥐들은이 지속적으로 불길을하지 않도록지만, 혼자 떠나는 쥐를 피하 그들은 사회적 동물이기 때문에, 기업이 필요 건강한 동물에서 분리해야합니다.

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Disclosures

CB와 KGC는 Airmid 주식 회사에 대한 공동 설립자 및 컨설턴트 아르

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Complete Freund’s Adjuvant Reagent Fisher Scientific DF 311-360-5 Manufactured by Difco
Mycobacterium tuberculosis H37Ra Reagent Fisher Scientific DF3114-33-8 Manufactured by Difco
DA rat Animal Harlan Laboratories Females, 7-9 weeks old.
Glass syringes - 5 ml Tool Fisher Scientific 14-823-10 B
Metal bridge - 18G Tool Fisher Scientific 14-825-17L
Luer Lok plastic syringes - 3 ml Tool BD Biosciences 309585
Needles - 20G 1 1/2 Tool Fisher Scientific 14-826-5C

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Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and Clinical Scoring of Chronic-Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (5), e224, doi:10.3791/224 (2007).More

Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and Clinical Scoring of Chronic-Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (5), e224, doi:10.3791/224 (2007).

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