Summary
Это видео демонстрирует индукции и клинических озвучивание животной модели рассеянного склероза: хронический рецидивирующий-экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита в DA крыс. Заболеваний, вызванных иммунизации крыс с эмульсию, содержащую все крысы спинного мозга и полного адъюванта Фрейнда, представляет клинические признаки напоминающие человеческие болезни.
Abstract
Рассеянный склероз (РС) является хроническим воспалительным заболеванием центральной нервной системы (ЦНС), который часто поражает молодых людей. Она характеризуется демиелинизации и глиальных пугать в районах распространены в головном и спинном мозге. Эти повреждения изменить нервной проводимости и вызывать отключение неврологические дефициты, которые меняются в зависимости от расположения демиелинизированные бляшек в центральной нервной системе (например, парапарез, паралич, слепота, недержание мочи).
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) представляет собой модель для РС. EAE была впервые индуцированных случайно у людей во время вакцинации против бешенства, используя вирусы, выращенные на кролика спинного мозга. Остатки спинного вводили инактивированные вирусы индуцированных поражение ЦНС. После этих наблюдений, первая модель EAE была описана в не-человеческое приматов, иммунизированных ЦНС гомогената по рекам и Schwenther в 1935 году. EAE с тех пор была сгенерирована за разнообразие видов и могут следовать разные курсы в зависимости от видов / напряжения и иммунизации антиген используется. Например, Льюис иммунизации крыс основному белку миелина в эмульсии с адъювантной вызывает острые модель EAE, в то время как тот же антиген вызывает хроническое заболевание у морских свинок.
Модель EAE, описанный здесь, индуцированные иммунизацией против крыс DA DA спинного мозга крыс в эмульсии в полном адъюванте Фрейнда. Крысы развивать восходящий вялый паралич в течение 7-14 дней после иммунизации. Клинические признаки следуют ремиттирующего курс в течение нескольких недель. Патология показывает большой иммунной проникает в ЦНС и демиелинизации бляшек. Особые соображения по уходу за животными с EAE описаны в конце видео.
Protocol
Индукция и мониторинга хронического рецидивирующего-EAE
Эмульсия смеси 1:1 антигена в водный раствор добавляется дополнен полного адъюванта Фрейнда. Это очень важно, чтобы добавить антигена адъювантной а не наоборот!
Существует большое количество отходов при принятии и потребителей инъекционных эмульсии. Всегда готовьте 1,5 или 2 раза больше, чем то, что вам нужно.
Используйте автоклаве раствором, пестик, стеклянные шприцы, и мосты. Все пластики должны быть стерильными. Препарат может быть сделано на регулярной лабораторном столе.
1. Подготовка дополнен адъювантной
Взвесьте 30 мг микобактерий туберкулеза (Difco каталога # 231141) и поместите в раствор. Убедитесь в тонкий порошок, не нажимая слишком сильно, чтобы избежать нарушения бактерий. Добавьте 10 мл Фрейнда адъювантной H37Ra (Difco каталога # 231131) и перемешать. Это дополнено адъювантной теперь содержит 4 мг / мл микобактерий туберкулеза. Трансфер в трубке.
2. Подготовка спинного гомогената шнур
Сбор спинной мозг от Д. А. крыс (возраст / пол равнодушным) и хранить замороженными при температуре -80 ° C. Взвесьте замороженное спинной мозг, чтобы иметь достаточно смешать 1:1 (вес: объем) с дополнены адъюванта. Фарш спинной мозг так хорошо, как возможно с лезвием, трансфер в раствор, использованный в разделе 1, и сделать пасту с пестиком.
3. Подготовка эмульсии
- Место дополнен полный адъювант Фрейнда в трубке. Vortex на высокой скорости. Добавить спинного мозга гомогената по капле в то время как вортексе. Когда все спинного гомогената шнур добавил, вихревые еще 5 минут. Смесь следует обратиться светло-розовый.
- Положите эмульсии в 5 мл шприц стекла и связать его с еще 5 мл стеклянный шприц использованием моста 18G (Fisher Каталог № 14-825-17L). Отправить эмульсии из шприца в другой, пока не становится трудно (5-10 мин). Если более 5 мл эмульсии готовят, используя несколько шприцов 5 мл НЕ использовать большие шприцы.
- Эмульсии могут быть сохранены в шприцах при 4 ° С в течение 3 недель. Я рекомендую его подготовке не менее 12 часов заранее, чтобы убедиться, что она не ломаются. Она должна оставаться толстыми, а не отдельно в 2 этапа. Цвет будет меняться в ночь на светло-желтый или бежевый.
4. Иммунизация крыс
- Смешайте эмульсии в шприцы в течение нескольких минут и трансфер в шприц для инъекций. Inject 200 мкл подкожно у самого основания хвоста использовании игл 23G и 3 мл Луер-Лок шприцы по краткосрочным наркозом.
- Получатели 7-9 недель самок крыс DA. Мы получаем наш крыс от Харлан-Sprague Dawley.
- Крысы должны быть соблюдены два раза в день и весил в день. Клинические признаки, как ожидается 7-15 дней после введения эмульсии.
Клинические подсчета очков:
0: нет болезни
0.5: дистальной вялым хвостом
1: хромать хвост
2: умеренный парапарез, атаксия
3: умеренные парапарез, крыс поездки, время от времени
3.5: одна задняя конечность парализован, другой движется
4: полный паралич задних конечностей
5: полный паралич задних конечностей и недержание мочи
6: умирающий, затруднение дыхания, не ешьте и не пейте. Усыпить сразу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть несколько важных соображений, для этого протокола.
Генетика крыс DA будет немного отличаться в зависимости от заводчика они купили у. Эти различия могут увеличить или уменьшить чувствительность крыс к EAE индукции. Если крысы более восприимчивы к EAE вы хотите, чтобы уменьшить силу иммунизации с использованием не-дополнены полного адъюванта Фрейнда или даже неполный адъювант Фрейнда. Вы можете также рассмотреть вопрос о сокращении количества эмульсии вводят или разбавления спинного гомогената шнур физиологическим раствором перед приготовлением эмульсии. Если крысы не развиваются клинические признаки EAE использованием полной силы иммунизации эмульсии проверить чистоту вашего субсидированного жилья. Крысы заражены паразитами (например, остриц) не будет развиваться EAE. Вы можете рассмотреть ваши жилищные животных при чистых условиях в автоклаве клетки с фильтр-топы, и давая им подкисленной водой вволю (протокол для подготовки подкисленной водой прилагается).
Эмульсия должна быть вода в масле так, чтобы масло в адъювантной полностью пальто антиген добавлении по каплям. Эмульсии подготовлены наоборот (масло в воде) станет таким же толстым, но не будет encephalitogenic.
Крысы дружелюбные животные, если они привыкли к своей обработчик, поэтому хорошая идея, чтобы обращаться с ними осторожно, ежедневно перед инъекцией encephalitogenic эмульсии. Это позволит снизить напряжение и риск укуса.
Животные с тяжелой EAE (3 балла или более) нуждаются в особом уходе. Крысы никогда не должны быть собраны за хвост, а в организме. Это тем более важно для снижения напряжения в больных животных. Это очень важно убедиться, что все животные должны иметь доступ к пище и воде, помещая пищу и гелевых пакетов в постельных принадлежностей и обеспечения долгосрочной sipper трубок на бутылки с водой. Крысы с EAE будут продолжать есть и пить, если животное остановиться либо есть или пить консультации ветеринара вашего института или усыпить животное. Больные крысы должны быть отделены от здоровых животных, чтобы убедиться, что они постоянно не растоптали, но не оставлять только крыс, так как они являются социальными животными и нуждаются в компании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ЦБ и KGC являются соучредителями и консультантов для Airmid ООО
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Freund’s Adjuvant | Reagent | Fisher Scientific | DF 311-360-5 | Manufactured by Difco |
| Mycobacterium tuberculosis H37Ra | Reagent | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Manufactured by Difco |
| DA rat | Animal | Harlan Laboratories | Females, 7-9 weeks old. | |
| Glass syringes - 5 ml | Tool | Fisher Scientific | 14-823-10 B | |
| Metal bridge - 18G | Tool | Fisher Scientific | 14-825-17L | |
| Luer Lok plastic syringes - 3 ml | Tool | BD Biosciences | 309585 | |
| Needles - 20G 1 1/2 | Tool | Fisher Scientific | 14-826-5C |
