La inducción y la puntuación clínica de enfermedades crónico-recurrente encefalomielitis autoinmune experimental

Summary

Este video muestra la puntuación de inducción y clínicas de un modelo animal de esclerosis múltiple: las enfermedades crónico-recidivante la encefalomielitis autoinmune experimental en ratas DA. La enfermedad, inducida por la inmunización de ratas con una emulsión que contiene la médula espinal de ratas y toda adyuvante completo de Freund, presenta un cuadro clínico parecido a la enfermedad humana.

Abstract

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria crónica del sistema nervioso central (SNC) que afecta comúnmente a los adultos jóvenes. Se caracteriza por la desmielinización y cicatrización glial en zonas diseminadas en el cerebro y la médula espinal. Estas lesiones alteran la conducción nerviosa e inducir el déficit neurológica incapacitante, que varían con la ubicación de las placas de mielina en el SNC (por ejemplo, paraparesia, parálisis, ceguera, incontinencia).

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo para la EM. EAE se les indujo accidentalmente en los seres humanos durante la vacunación contra la rabia, a partir de virus cultivados en la médula espinal de conejo. Los residuos de inyección espinal con el virus inactivado induce la enfermedad del SNC. A raíz de estas observaciones, un primer modelo de EAE se ha descrito en primates no humanos inmunizados con un homogeneizado de SNC por los ríos y Schwenther en 1935. EAE ha sido generada en una variedad de especies y pueden seguir diferentes cursos en función de la especie / variedad y la inmunización de antígeno utilizado. Por ejemplo, la inmunización de ratas Lewis con la proteína básica de mielina en emulsión con adyuvante induce un modelo de EAE aguda, mientras que el mismo antígeno induce una enfermedad crónica en los conejillos de indias.

El modelo de EAE se describe aquí es inducida por la inmunización de ratas DA contra la médula espinal de ratas DA en emulsión en adyuvante completo de Freund. Ratas desarrollan una parálisis flácida ascendente dentro de 7-14 días después de la inmunización. Los signos clínicos siguen un curso remitente-recurrente durante varias semanas. Patología muestra gran infiltrado inmune en el SNC y las placas de desmielinización. Consideraciones especiales para el cuidado de los animales con EAE se describen al final del vídeo.

Protocol

Inducción y control de enfermedades crónico-recurrente de EAE

La emulsión es una mezcla de 1:1 de antígeno en solución acuosa añadido a complementarse adyuvante completo de Freund. Es muy importante añadir el antígeno al adyuvante y no al revés!

Hay una gran cantidad de residuos y la hora de hacer la inyección de una emulsión. Siempre prepare 1,5 o 2 veces más de lo que usted necesita.

El uso de mortero en autoclave, maja, jeringas de vidrio, y los puentes. Todos los plásticos deben ser estériles. La preparación se puede hacer en una mesa de laboratorio periódicas.

1. Preparación de la coadyuvante complementado

Pesar 30 mg de Mycobacterium tuberculosis (Difco Catálogo # 231141) y ponerlo en un mortero. Convertirlo en polvo fino, sin presionar demasiado para no romper las bacterias. Añadir 10 ml de adyuvante completo de Freund H37Ra (Difco Catálogo # 231131) y mezclar. Este adyuvante complementado ahora contiene 4 mg / ml de Mycobacterium tuberculosis. Transferir a un tubo.

2. Preparación del homogenado de médula espinal

Recoger la médula espinal de ratas DA (edad / sexo no importa) y almacenar congelados a -80 ° C. Pesar la médula espinal congelados para tener suficiente para mezclar 1:1 (peso: volumen) con el adyuvante complementado. Picar la médula espinal tan fina como sea posible con una hoja de afeitar, la transferencia del mortero utilizado en la sección 1, y hacer una pasta con la mano del mortero.

3. Preparación de la emulsión

1. Lugar complementado adyuvante completo de Freund en un tubo. Vortex a alta velocidad. Añadir la caída de la médula espinal homogenado a gota y agitación. Cuando todos los homogeneizado de la médula espinal, se añade, vortex por 5 minutos más. La mezcla se debe a su vez de color rosa claro.
   
   
2. Ponga la emulsión en una jeringa de 5 ml de vidrio y vincularlo a otra jeringa de vidrio de 5 ml con un puente 18G (catálogo Fisher º 14-825-17L). Enviar la emulsión con una jeringa a otra hasta que se vuelve difícil (5-10 min). Si hay más de 5 ml de la emulsión se prepara, use varias jeringas de 5 ml NO utilice jeringas más grandes.
   
   
3. La emulsión puede ser almacenada en las jeringas a 4 ° C durante 3 semanas. Recomiendo la preparación de por lo menos 12 horas de anticipación para verificar que no se descompone. Debe permanecer espesa y no por separado en dos fases. El color va a cambiar durante la noche para una luz de color amarillo o beige.

4. La inmunización de las ratas

1. Mezcla de la emulsión en las jeringas durante unos minutos y traslado a la jeringa utilizada para la inyección. Inyectar 200 l por vía subcutánea en la base misma de la cola el uso de agujas 23G y jeringas de 3 ml Luer-Lock a corto plazo con la anestesia.
   
   
2. Los beneficiarios son las 7-9 semanas de edad las ratas hembras DA. Tenemos nuestras ratas de Harlan Sprague Dawley.
   
   
3. Las ratas deben ser observadas dos veces al día y pesados ​​diariamente. Los signos clínicos se espera 7-15 días después de la inyección de la emulsión.
   

Puntuación clínica:

0: sin enfermedad

0.5: cojera cola distal

1: la cola cojera

2: paraparesia leve, ataxia

3: paraparesia moderada, los viajes de las ratas de vez en cuando

3.5: una pata trasera está paralizado, el otro se mueve

4: parálisis completa las extremidades posteriores

5: parálisis completa las extremidades posteriores y la incontinencia

6: respiración moribunda, la dificultad, no comer ni beber. La eutanasia de inmediato.

Discussion

Hay algunas consideraciones importantes para este protocolo.

La genética de las ratas DA variará ligeramente dependiendo del criador que se compran. Estas diferencias pueden aumentar o disminuir la susceptibilidad de las ratas de EAE la inducción. Si su ratas son más susceptibles a la EAE tendrá que reducir la fuerza de la vacunación mediante el uso sin suplemento completo de Freund adyuvante o neoadyuvante aunque incompleto de Freund. También puede considerar la reducción de la cantidad de emulsión inyecta o diluir el homogeneizado de la médula espinal, con solución salina antes de preparar la emulsión. Si su ratas no desarrollan signos clínicos de la EAE con la fuerza completa inmunización de emulsión de comprobar la limpieza de sus instalaciones de la vivienda. Ratas infectadas con parásitos (como lombrices) no se desarrollan EAE. Usted puede considerar la vivienda a sus animales en las condiciones más limpia en jaulas autoclave con filtro de las copas, y darles agua acidificada ad libitum (el protocolo para la preparación de agua acidificada se adjunta).

La emulsión debe ser agua en aceite para que el aceite en la capa de adyuvante completo el antígeno se agrega gota a gota. Una emulsión preparada al revés (de aceite en agua) llegue a ser tan grueso, pero no se encefalitogénico.

Las ratas son animales amistosos si están acostumbrados a su manejador, por lo que es una buena idea para manejarlos con cuidado sobre una base diaria antes de la inyección de la emulsión encefalitogénico. Esto reducirá el estrés y el riesgo de una mordedura.

Animales con EAE grave (puntuación de 3 o más) necesitan un cuidado especial. Las ratas no deben ser recogidos por la cola, sino más bien por el cuerpo. Esto es aún más importante para reducir el estrés en los animales enfermos. Es muy importante asegurarse de que todos los animales tienen acceso a los alimentos y el agua colocando los paquetes de alimentos y el gel en la ropa de cama y proporcionar a largo sorber los tubos de las botellas de agua. Las ratas con EAE continuará comiendo y bebiendo, si un animal puede dejar de comer o beber consultar el veterinario de su instituto o la eutanasia de los animales. Ratas enfermas deben ser separados de los animales sanos para asegurarse de que no están constantemente pisoteados, pero evite las ratas dejan en paz, ya que son animales sociales y necesitan compañía.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s Adjuvant	Reagent	Fisher Scientific	DF 311-360-5	Manufactured by Difco
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	Reagent	Fisher Scientific	DF3114-33-8	Manufactured by Difco
DA rat	Animal	Harlan Laboratories		Females, 7-9 weeks old.
Glass syringes - 5 ml	Tool	Fisher Scientific	14-823-10 B
Metal bridge - 18G	Tool	Fisher Scientific	14-825-17L
Luer Lok plastic syringes - 3 ml	Tool	BD Biosciences	309585
Needles - 20G 1 1/2	Tool	Fisher Scientific	14-826-5C