Assaying β-Amyloid-Toxizität mit Hilfe eines transgenen C. elegans Modell

Summary

Die intensiv studiert Fadenwurm

Abstract

Akkumulation des β-Amyloid-Peptid (Aß) wird allgemein angenommen, eine zentrale Rolle bei der Induktion der Alzheimer-Krankheit, sondern den entsprechenden Mechanismus (s) der Toxizität sind noch unklar. Aß ist auch intramuskulär in Inclusion Body Myositis, eine schwere menschliche Myopathie hinterlegt. Die intensiv studiert Fadenwurm Caenorhabditis elegans kann transgen entwickelt werden, um menschliche Aß Ausdruck zu bringen. Je nach Gewebe-oder Timing der Aß Ausdruck können transgene Würmer leicht messbaren Phänotypen, die als read-out von Aß Toxizität dienen. Zum Beispiel haben transgene Würmer mit pan-neuronalen Aß Ausdruck Mängel ist assoziativen Lernens (Dosanjh et al 2009.), Während transgene Würmer mit konstitutiver Muskel-spezifische Expression zeigen eine progressive, altersabhängige Lähmung Phänotyp (Link, 1995; Cohen et al . 2006). Eine besonders nützliche C. elegans Modell beschäftigt temperatursensitive Mutation in der mRNA-Surveillance-System auf Temperatur-induzierbaren Muskel Ausdruck einer Aß Transgen-Ingenieur, was zu einer reproduzierbaren Lähmung Phänotyp der Temperatur Hochschalten (Link et al. 2003). Behandlungen, die gegen Aß Toxizität in diesem Modell [z. B. Ausdruck einer schützenden Transgen (Hassan et al. 2009) oder durch Einwirkung von Ginkgo biloba-Extrakten (Wu et al. 2006)] reproduzierbar verändern die Rate der Lähmung durch die Temperatur Hochschalten dieser transgenen induzierten Würmer. Hier beschreiben wir unsere Verfahren zur Messung der Geschwindigkeit der Lähmung in diesem transgenen C. elegans-Modell, mit besonderem Augenmerk auf experimentellen Variablen, dass diese Messung beeinflussen können.

Protocol

1) Vorbereiten Nematode Growth Medien Platten für Lähmungen Assay.

Paralysis Assays basieren auf dem Standard Nematode Growth Media (NGM) Platten routinemäßig für C eingesetzt durchgeführt elegans Vermehrung und Genetik (Stiernagle, 2006).

1. Autoclave der NGM Lösung mit NaCl, Agar und Pepton in einem Erlenmeyerkolben und fügen Sie die entsprechenden Mengen an sterile CaCl _2, Uracil, Cholesterin, 1M MgSO ₄ und 1 M KPO _4. Aliquot von 10 ml Flüssigkeit NGM in jeweils 60 mm x 15 mm Petrischale. Lassen NGM über Nacht erstarren bei Raumtemperatur.
2. Wenn der Test für die Wirkungen von Verbindungen / Extrakte, Aliquot des Extraktes auf jede Platte und mit einem Spreader zur gleichmäßigen Verteilung der Auszug über die Oberfläche der Platte. Lassen Sie zu extrahieren, um über Nacht bei Raumtemperatur trocknen. Mehr als 1 ml benötigen mehr Zeit zum Trocknen.
3. Spot jede Platte mit 250 ul E. coli-Stamm OP5O in LB-Medium über Nacht bei einer optischen Dichte von 0,4-0,6 gewachsen. Lassen Bakterien über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.

Relevante Variablen

Das Alter der Platten hat einen signifikanten Einfluss auf die Lähmung Assay, da ältere Platten zum Austrocknen neigen. Verwenden Platten gegossen innerhalb einer Woche nach Lähmung Assay. Für optimale Ergebnisse, Platten gießen 3-4 Tage vor Beginn der synchronen Wurm Bevölkerung [siehe (2) unten]. Für jedes Experiment, verwenden Sie nur Platten aus der gleichen Charge gegossen.

Das Ändern der Größe der Rasenfläche (dh gesichtet vs Spread) und / oder die Art der Bakterien verändern auch das Verhalten der Würmer. Paralysis Assays können unter Verwendung alternativer E. werden coli-Stämme als Nahrungsquelle (z. B. das HT115 Belastung in der Fütterung RNAi-Experimente verwendet werden), aber das kann die Kinetik der Lähmung ändern und erfordern somit angemessene interne Kontrollen.

2) Herstellung von Age-Synchron-Worm Populationen

Der Stamm CL4176 (SMG-1 (cc546 ^ts) I; dvIs27 [myo-3 / Aß Minigen + rol-6 (su1006) Markergen] X wird am häufigsten für die Bestimmung von Aß-induzierte Lähmungen Dieser Stamm und andere transgene Modelle stehen zur Verfügung. die akademische Forscher für eine geringe Gebühr von der Caenorhabditis Genetics Center (http://www.cbs.umn.edu/CGC/).

1. Um das Alter Synchronität der Test Bevölkerung ist es besser, mit einem synchronisierten elterlichen Generation beginnen zu maximieren. Eine Woche vor der Einleitung des Lähmung Test des Tests Bevölkerung, mit einem Platin-Wurm-Picker auf 20-30 gravid Erwachsenen auf mehrere 10 cm NGM-Platten mit OP50 für eine 2-stündige Eiaufstrich Übertragung lag bei 16 ° C (der permissiven Temperatur für CL4176 ). Entfernen Sie die gravid Erwachsenen und damit die Nachkommenschaft zu 7 Tage lang wachsen, in welcher Zeit sie werden "zweiten Tag" gravid Erwachsene.
2. (Tag 1) Der zweite Tag gravid Erwachsene werden verwendet, um die alters-Synchron-Test der Bevölkerung vorzubereiten. Für jeden experimentellen Zustand des Objekts ist dreifacher Ausfertigung Platten mit 50-75 Jahren-Synchron-Würmern zu generieren. Mit einem Platin-Wurm-Picker, Transfer 10-12 der Tag 2 gravid Erwachsenen auf 60 mm (10 ml Volumen) NGM-Platten mit OP50 gesichtet. Lassen Sie die Würmer Eier bei 16 ° C lag 2 Stunden, dann wählen Sie die Erwachsenen und lassen Eier auszubrüten und wachsen bei 16 ° C. An dieser Stelle ist es am besten jemanden, der nicht sein wird Scoring die Platten, um sie Code haben, so der Torschütze wird blind sein, um experimentellen Bedingungen.

Relevante Variablen

Das Stadium der embryonalen Entwicklung, wenn Eier gelegt werden (~ der 26-Zell-Stadium für Wildtyp-Würmern unter optimalen Bedingungen) ist eine Funktion von erwachsenen Alter und Ernährung. Wenn die gravid Erwachsene zur Vorbereitung des Tests Bevölkerung genutzt ältere oder verhungert sind, wird später Eier gelegt werden, wodurch das Alter Synchronität der Bevölkerung und die Reproduzierbarkeit der Lähmung Kinetik. Es ist wichtig, als Mono-axenic (dh nur OP50 Bakterien) Kulturen verwendet werden (mikrobielle Verunreinigungen stark beeinträchtigt diesen Test) und die Reproduzierbarkeit ist am höchsten, wenn der dreifach Platten ähnliche Anzahl von Würmern haben.

3) Transgene Induktion und Paralysis Assay

1. (Tag 3) Hochschalten Platten bis 25 ° C 48 Stunden nach dem Ende des Synchron-Ei legen, Würmer sollten bei der dritten Larvenstadium (L3) werden. Die Platten sollten ohne Stapeln in einem 25 ° C Inkubator, damit alle Platten bis 25 ° C zur gleichen Zeit zu erreichen arrangiert werden.
2. (Tag 4) Begin der Punktwertung der Lähmung der Würmer (Stamm CL4176) bei 18-20 Stunden nach Beginn der Hochschalten. Zu diesem Zeitpunkt sollten alle Würmer in der Bevölkerung das vierte Larvenstadium (L4) Stadium erreicht haben. Weiter Scoring in zwei-Stunden-Schritten, bis alle Würmer auf jede der Platten gelähmt sind. Aus unbekannten Gründen ist Lähmung nicht einmal über den Körper Länge: Kopfbereich ist der letzte Teil des Wurms aufhören zu bewegen. So wORMs, die vor kurzem Lähmung eingeleitet haben nicht über die Platte zu übersetzen, sondern können ihre Köpfe zu bewegen, dabei werden Bakterien in ihrer vorderen und Verlassen eines "Halo" geräumte Bakterien. Diese Würmer werden immer völlig gelähmt, und deshalb Würmer mit Halos sind kategorisiert als gelähmt. Einige Würmer werden nicht Halos, aber auch nicht zeigen spontane Bewegung; diese werden durch Drängen mit dem Wurm Picker getestet. Wenn ein prodded Wurm nicht eingehen kann eine Ganzkörper-Wellenausbreitung auf Drängen ist es auch erzielt, wie gelähmt. Für eine effiziente Scoring, ist es am einfachsten, den gelähmten Würmer zu einer unbefleckt Sektor der Platte zu bewegen, so dass sie nicht ungewollt rescored das nächste Scoring Zeitraum. (Dies ermöglicht auch mis-kategorisiert Würmer Bewegung zeigen, so dass ein Scoring-Korrektur).
3. Zur Erzeugung einer Lähmung Kurve zu jedem Zeitpunkt den Anteil der Würmer auf jeder Platte, die nicht gelähmt ist, um einen Prozentsatz umgewandelt, und die durchschnittliche "unparalyzed" Prozentsatz der Zeit von Hochschalten Einleitung dargestellt. (Die Begründung für das Plotten auf diese Weise, dass die resultierende Kurve formal analog zu einem Überleben Kurve ist, und kann daher mittels Standard nicht-parametrische Statistiken Überleben werden.)

Relevante Variablen

Das Hochschalten von transgenen myo-3/Aβ Würmer auftreten müssen, bevor sie Mitte der L4 Bühne für Lähmungen erreichen eingeleitet, wie die myo-3 Promotor ist entwicklungsmäßig reguliert werden, und hat maßgeblich Ausdruck in späten L4 oder erwachsenen Würmer reduziert. Ebenso ist Ausdruck dieses Transgen blockiert, wenn Würmer ausgehungert werden, so ist es wichtig, dass die Würmer während des gesamten Experiments gut genährt sind. Wir haben noch nie einen gelähmten Wurm unter allen Bedingungen zu erholen beobachtet, und nach 12-16 h Hochschalten, alle CL4176 Würmer lähmt, auch wenn sie auf 16 ° C sind heruntergeschaltet In Belastung CL4176, um eine ausreichende Hochregulation der Transgenexpression Lähmung kann bei niedrigeren Temperaturen auftreten (dh 20-25 ° C), obwohl der Zeitpunkt der Lähmung wird verändert werden. Die Lähmung ist abhängig von der spezifischen transgenen Stamm (wir haben myo-3/Aβ Stämme mit schneller und langsamer auf als CL4176 gebaut), so mit alternativen Stämme der Scoring-Fenster muss unter Umständen angepasst werden.

4) Repräsentative Ergebnisse

In Abbildung 1 ist ein Grundstück von einer Lähmung Kurve für CL4176, sowohl unbehandelt und ausgesetzt und 6,27 mM Koffein (Endkonzentration in NGM-Platte). Diese Behandlung führt zu einer statistisch hoch signifikante Verzögerung in Lähmung von ca. 4 Stunden, die wir interpretieren als Indikator für die Unterdrückung von Aß Toxizität in diesem Modell. In Abbildung 2 ist ein unabhängiges Experiment Untersuchen der Auswirkungen von Cafestol, eine andere Verbindung in Kaffee zu finden. Dieses Grundstück ist typisch für Behandlungen, die nicht Einfluss haben Aß Toxizität. Beachten Sie, dass in beiden Versuchen etwa die Hälfte der unbehandelten CL4176 Bevölkerung bei 24 Stunden sind wie gelähmt, und die Lähmung ist komplett um 28 Stunden. Dies sind typische Zeitrahmen für die Lähmung der Kontrolle CL4176 Populationen. Wesentliche Abweichungen von diesem Zeitpunkt sind bezeichnend für veränderte Umgebungsbedingungen oder spontane Deletion der Transgen-Kopien. (CL4176 enthält eine chromosomal integrierte transgene Array mit mehreren Kopien des Transgens myo-3/Aβ. Obwohl diese transgenen Array wird in der Regel recht stabil, der die Verbreitung des Stammes bei Temperaturen> 16 ° C wird für seltene Würmer, die eine unterzogen haben wählen spontane Löschung von Transgenen, die sich in Varianten, die Aß Ausdruck und langsamer Lähmung Ergebnisse reduziert werden.)

Abbildung 1. Paralysis Kurve für DMS CL4176 Würmer unbehandelt oder ausgesetzt und 6,27 mM Koffein (Sigma). Die angegebenen Zeiten sind von der Einleitung des Temperatur Hochschalten. Fehlerbalken = SEM

Abbildung 2. Paralysis Kurve für CL4176 Würmern ausgesetzt auf 0,48 mM Cafestol (Sigma). Fehlerbalken = SEM

Discussion

Das Protokoll wir beschrieben haben, können effektiv zum Testen der Auswirkungen von Verbindungen auf Aß Toxizität verwendet werden. Veröffentlicht Beispiele sind die Effekte von Ginkgo biloba-Extrakt Bestandteile (Wu et al. 2006) und Reserpin (Arya et al. 2009). Verbindungen, die Schutz gegen Aß Toxizität in anderen Systemen haben, haben auch gezeigt, dass sein Schutz in diesem Modell (zB Memantin, unsere unveröffentlichte Ergebnisse). Ein wichtiger Grund für die Erstellung dieses Modells ist, dass die gut entwickelten genetischen und molekularen Werkzeugen in C verfügbar elegans kann verwendet werden, um Mechanismen der Aß Toxizität untersucht werden. So können die Auswirkungen spezifischer Mutationen auf Aß Toxizität untersucht (zB den Effekt der Reduzierung Insulin-like-Signalisierung durch die Einführung einer daf-2 loss-of-function-Mutation, Florez-McClure et al. 2007), und dieses Modell kann auch verwendet werden, um die Auswirkungen der Überexpression Transgene (Fonte et al. 2008) zu untersuchen. Wir haben vor kurzem umfangreiche Verwendung dieses Modells gemacht, um die Auswirkungen auf die Toxizität der einzelnen Aminosäure-Substitutionen in Aß (unveröffentlichte Daten) zu untersuchen.

Die transgenen Modell hier beschriebenen Tests die Wirkung einer akuten Aß Ausdruck auf Muskel-Zell-Funktion. Zur Zeit der Lähmung Muskelzellen und deren Sarkomer sind intakt; die Lähmung Phänotyp ist nicht das Ergebnis einer Muskelzelle Tod. Doch nach der Lähmung (~ 48 Stunden nach der ersten Hochschalten) gibt es einen Abbau der Muskeln, Integrität und schließlich zum Tod der Würmer. Wir haben nicht diesen nachgeschalteten Wirkung von Aß Ausdruck untersucht oder verwendet es als eine Toxizität Marker.

Die induzierbare Aß Ausdruck hier beschriebene Modell ist nicht geeignet für die Untersuchung von Behandlungen, die β-Amyloid-Bildung per se modulieren. Obwohl transgene Würmer mit konstitutiver Aß Ausdruck Form leicht erkennbar Amyloid-Ablagerungen (Fay et al 1998;.. Link et al 2001), transgene Würmer mit induzierbarer Aß Ausdruck selten Amyloid-Ablagerungen und die Lähmung Phänotyp scheint unabhängig von Amyloid-Ablagerung (Drake et al. 2003). Unsere Ergebnisse stimmen mit der Auffassung, dass die akute Toxizität von induzierten Aß Ausdruck ergibt sich aus der Ansammlung von löslichem oligomeren Aß, nicht Amyloid-Ablagerung.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl (6g)	Sigma-Aldrich	S9888
Agar (40g)	Sigma-Aldrich	A7002
Peptone (5g)	Sigma-Aldrich	P0556
ddH2O (2L)
1M CaCl2 (2mL)			147.02mg/mL in ddH2O
Uracil (2mL)			2mg/mL in ddH2O
Cholesterol (2mL)			5mg/mL in ethanol (do not autoclave)
1M MgSO4 (2mL)			246.5mg/mL in ddH2O
1M KPO4 (50mL)			98mg KH2PO4.mL, 48mg K2HPO4/mL in ddH2O, pH
Erlenmeyer Flask	VWR international