Summary
강렬한 공부 선충류 벌레
Abstract
β - 아밀로이드 펩티드 (Aβ)의 축적은 일반적으로 알츠하이머 질병의 유도 중심으로 생각하지만, 독성의 관련 메커니즘 (들)은 아직 명확하지가있다는거다. Aβ는 또한 포함 바디 Myositis, 심한 인간 myopathy에 intramuscularly 입금됩니다. 강렬한 공부 선충류 웜 Caenorhabditis의 엘레간스는 transgenically 인간의 Aβ를 표현하기 위해 설계하실 수 있습니다. Aβ 표현의 조직이나 타이밍에 따라, 유전자 변형 벌레는 Aβ 독성의 읽기 아웃 역할을 쉽게 측정 phenotypes 수 있습니다. 세스 외, 예를 들어, 범 -의 연결 Aβ 표현과 함께 유전자 변형 벌레가 제정 근육 특정 표현과 함께 유전자 변형 웜은 프로 그레시브, 나이에 의존 마비의 표현형을 (링크 1995 표시하면서 결함이 연관 학습 (. Dosanjh 외 2009)입니다했습니다 . 2006). 하나는 특히 유용 C. 엘레간스 모델은 온도 upshift (링크 외. 2003)에 재현할 마비의 표현형의 결과, Aβ transgene의 온도 inducible 근육 표현을 엔지니어로 mRNA 감시 시스템의 온도에 민감한 돌연변을 사용합니다. 이 모델에서 카운터 Aβ 독성이 [예, 보호 transgene (핫산 외. 2009)의 표현이나 징코 빌로바 추출물 (우 외. 2006)에 노출] reproducibly 이러한 유전자 변형의 온도 upshift에 의해 유도된 마비의 속도를 변경할 것을 처리 웜. 여기 우리는이 유전자 변형 C.에 마비의 속도를 측정을위한 프로토콜을 설명 이 측정에 영향을 미칠 수 실험 변수에 특히주의와 엘레간스 모델.
Protocol
1) 마비 분석에 대한 선충류 성장 미디어 번호판을 준비.
마비의 assays는 정기적으로 C.에 사용되는 표준 선충류 성장 미디어 (NGM) 접시에 수행됩니다 엘레간스 전파 및 유전학 (Stiernagle, 2006).
- NaCl, Erlenmeyer 플라스크에 아가르 및 펩톤가 포함된 NGM 솔루션을 압력솥 및 살균 CaCl 2, 유라실, 콜레스테롤, 1M MgSO 4와 1M KPO 4의 적절한 금액을 추가합니다. 각 60mm X 15mm 페트리 접시에 액체 NGM의 나누어지는 10 ML. NGM는 실온에서 하룻밤 응고 수 있습니다.
- 각 플레이트에 화합물 / 추출, 나누어지는 추출물의 효과에 대한 테스트 및 균일하게 접시의 표면에 걸쳐 추출을 배포하는 확장기를 사용하는 경우. 실온에서 하룻밤 건조 추출 수 있습니다. 1 ML 이상의 볼륨은 건조 시간이 더 필요합니다.
- E. 250 μL와 각각의 접시 스팟 콜리 변형 OP5O는 0.4-0.6의 광학 밀도에 대한 야간 LB 미디어 재배. 박테리아가 실온에서 하룻밤 건조하도록 허용합니다.
관련 변수
접시의 나이는 나이가 접시 밖으로 건조하는 경향으로 마비 분석에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 사용 번호판 마비가 분석 한 주일 이내에 부어. 이상의 결과를 얻으려면, 3-4일 [(2) 아래 참조] 동기 웜 인구의 개시 전에 접시를 붓는다. 모든 실험은 같은 배치에서 부어 접시만을 사용합니다.
잔디밭의 크기 (즉, 발견 대 보급) 및 / 또는 박테리아의 종류를 변경하면 벌레의 동작을 변경합니다. 마비의 assays는 대체 E.를 사용하여 수행할 수 음식 소스 (예 : RNAi 실험을 먹이에 사용되는 HT115 변형)하지만,이 때문에 적절한 내부 통제가 필요 마비의 속도론을 변경할 수있는 대장균의 변종.
연령 동기 웜 인구 2) 준비
스트레인 CL4176 (smg - 1 (cc546 TS) I; dvIs27 [묘는 - 3 /는 Aβ minigene는 + rol - 6 (su1006) 마커 유전자]는 X 가장 일반적으로 Aβ 유발 마비 시금에 사용이 부담 및 기타 유전자 변형 모델을 사용할 수 있습니다. Caenorhabditis 유전학 센터 (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)에서 소정의 수수료 학술 연구자 수 있습니다.
- 그것이 동기 부모 세대와 함께 시작하는 것이 바람직합니다 테스트 인구의 연령 synchrony을 극대화합니다. 주일 전에는 시험 인구의 마비 분석을 시작, 16 시에 누워 2 시간 달걀에 대한 OP50로 확산 여러 10cm의 NGM 플레이트에 20-30 gravid 성인 전송하는 플래티넘 웜 선택 도구를 사용하여 ° C (CL4176에 대한 허용 온도 ). gravid 어른을 제거하고 자손 어떤 시간에 그들이 gravid 성인 "두번째 날"될 것입니다 7 일 동안 성장할 수 있습니다.
- (1 일) 두 번째 일 gravid 성인 연령 동기 테스트 인구를 준비하는 데 사용됩니다. 각 실험 조건에 대해 개체가 50-75 연령 동기 벌레가 들어있는 세중의 플레이트를 생성하는 것입니다. 플래티넘 웜 선택 도구를 사용하여 OP50와 함께 발견 60mm (10 ML 볼륨) NGM 플레이트에 2 일 gravid 성인의 10-12를 전송할 수 있습니다. 웜은 다음 어른을 선택하고 계란이 부화 수 있도록 16에서 성장, 2 시간 동안 16 ° C에서 알을 낳기 위해 ° C. 허용 이 시점에서 그것을 코드에 번호판을 채점하지 않습니다 누군가를 위해 최상이고, 득점은 실험 조건에 장님이 될 것입니다.
관련 변수
계란이 여자랑 아르 배아 발달의 단계 (~ 최적의 조건 하에서 야생 타입 벌레에 대한 26 세포 단계)가 성인 연령과 영양의 기능입니다. 테스트 인구의 준비에 사용되는 gravid 성인 나이가 아니면 굶어 죽었을 경우, 나중에 무대 달걀은 인구 및 마비의 속도론의 재현성의 나이 synchrony 감소 마련됩니다. 그것은 문화가 (미생물 오염이 심각한이 분석에 영향을 줄 수 있습니다) 사용되는 모노 axenic (즉, 전용 OP50 박테리아)보다 필수적이며, 세중의 플레이트는 벌레 비슷한 숫자가있는 경우 재현성이 높은 것입니다.
3) Transgene 유도 및 마비 분석
- (3 일) 25 Upshift 번호판 ° C 48 시간 동기 계란의 끝 이후에 누워, 벌레는 세 번째 단계 애벌레 (L3)에 있어야합니다. 접시는 모든 접시가 동시에 25 ° C에 도달 수 있도록 25 ° C 배양기에서 스태킹없이 배치하여야한다.
- (주 4) upshift의 개시 후 18-20 시간에 벌레의 마비 (변형 CL4176)를 채점 시작합니다. 이 시점에서, 인구의 모든 벌레는 네 번째 애벌레 (L4) 단계에 도달한다. 접시의 각 모든 벌레가 마비가 될 때까지 두 시간 단위로 계속 점수. 알 수없는 이유로 마비도 신체의 길이에 걸쳐되지 않습니다 머리 지역은 이동 중단에 대한 웜의 마지막 부분입니다. 따라서, W최근 마비를 시작했습니다 옴스은 접시를 통해 번역할 수는 없지만,이를 통해 자신의 앞쪽에 주변 박테리아를 지우고 삭제 박테리아의 "후광"를 떠나, 그들의 머리를 이동할 수 있습니다. 이 벌레는 결국에 완전히 마비 될 것입니다, 그리고 마비로 따라서 halos과 벌레가 분류됩니다. 일부 웜은 halos을하지 않습니다뿐만 아니라 자발적인 움직임을 보이지 않습니다, 이러한 웜 따는로 괴롭히는하여 테스트합니다. prodded 웜이 괴롭히는시 몸 전체에 웨이브 전파를 받아야 수없는 경우 마비로, 그것도 점수입니다. 효율적인 채점을 위해, 그것은 그들이 실수로 다음 채점 기간을 rescored되지 않습니다 않도록 접시의 얼룩이없는 분야에 마비가 벌레를 이동하는 가장 쉬운 방법입니다. (이 또한 점수 정정을 허용함으로써, 잘못 분류 웜은 움직임을 보여줄 수 있습니다.)
- 마비 곡선을 생성하려면 각 시점에 마비되지 않은 각 접시에 벌레의 분율은 비율로 변환되며, 평균 "unparalyzed"비율 upshift 개시부터 시간이 역모를 꾸몄다입니다. (이 방식으로 음모를 꾸미고에 대한 근거는 결과 곡선은 생존 곡선을 공식적으로 유사하고, 따라서 표준이 아닌 파라메 트릭 생존 통계를 사용하여 분석할 수있다.)
관련 변수
그들이 묘 - 3 발기인이 발달 규제로 시작되어야하고, 상당히 늦은 L4 또는 성인 웜의 표현을 감소했습니다 마비에 대한 중간 L4 단계에 도달하기 전에 유전자 변형 myo-3/Aβ의 웜의 upshift가 발생합니다. 마찬가지로,이 transgene 표현이 웜은 굶어 될 경우 차단하므로 벌레들이 실험을하는 동안 잘 공급되는 필수입니다. 그들이 16 ° C.에 downshifted 경우에도, 우리는 어떠한 조건에서 복구하기 마비 벌레 관찰 적이 있고, upshift의 12-16 시간 후, 모든 CL4176 벌레가 마비됩니다 변형 CL4176에서 transgene 표현의 충분한 upregulation 마비의 타이밍이 변경될 수 있지만 마비 (즉, 20-25 ° C) 낮은 온도에서 발생할 수 있습니다 발생할 수 있습니다. 마비의 비율이 사용하는 특정 유전자 변형 응력 (우리가 CL4176보다 빠르고 느린 속도 모두 myo-3/Aβ 변종을 만들었다는)에 의존하므로 다른 변종으로 점수 창이 조정해야 할 수도 있습니다.
4) 대표 결과
치료과 카페인 6.27 MM (NGM 플레이트에 최종 농도)에 노출 모두에 대해 CL4176 마비 곡선의 플롯은, 그림 1에 표시됩니다. 이 치료 우리가이 모델의 Aβ 독성의 억제 기준으로 나타내는 해석 약 4 시간의 마비에 높은 통계적으로 의미있는 지연을 초래합니다. 그림 2에 표시된 것은 cafestol, 커피에있는 다른 화합물의 효과를 시금 독립적인 실험이다. 이 음모는 Aβ 독성에 영향을주지 않습니다 치료에 대한 일반적입니다. 두 실험의 절반에 대한 치료 CL4176 인구가 24 시간에서 마비 및 마비 28 시간으로 완료됩니다. 이러한 제어 CL4176 인구의 마비에 대한 전형적인 timeframes 있습니다. 이시기의 중요한 편차는 변경 환경 조건이나 transgene 사본의 자발적인 삭제 나타내는 있습니다. (CL4176은 myo-3/Aβ transgene의 복사본이 여러 개있는 chromosomally 통합 유전자 변형 배열이 포함되어 있습니다.이 유전자 변형 배열이 정상적으로 상당히 안정이지만, 온도에서 변형의 전파는> 16 ° C는 A를받은 희귀한 벌레에 대한 선택합니다 Aβ 표현과 느린 마비 결과를 감소해야합니다 변종의 발생 transgenes의 자발적인 삭제,.)
그림 1. CL4176 웜 치료 또는 6.27 MM의 카페인 (시그마)에 노출 변형율에 대한 마비의 곡선. 표시된 시간은 온도 upshift의 개시부터입니다. 오류 바 = SEM
그림 2. 0.48 MM cafestol (시그마)에 노출 CL4176 벌레에 대한 마비 커브. 오류 바 = SEM
Discussion
우리가 설명이 프로토콜은 효율적으로 분석 Aβ 독성에 대한 화합물의 효과를 위해 사용될 수 있습니다. 게시 예제는 징코 빌로바 추출물의 성분의 영향 (우 외. 2006)과 reserpine을 (아리아 외. 2009 년) 등이 있습니다. 다른 시스템에서 Aβ 독성에 대한 보호되었습니다 화합물도 (예, memantine, 우리되지 않은 결과)이 모델에서 보호하는 표시되었습니다. 이 모델 수립을위한 중요한 근거는 C.에서 잘 개발된 유전자와 분자 도구를 사용할 수 있습니다 엘레간스는 Aβ 독성의 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 Aβ 독성에 미치는 영향 특정 돌연변이 (예, DAF - 2 손실 기능 돌연변이, Florez - 매클루레 외. 2007 년 도입하여 신호와 같은 인슐린을 줄이는 효과) assayed,이 모델은 또한 수 있습니다 과잉 표현 transgenes (폰트 외. 2008)의 영향을 조사하는 데 사용됩니다. 우리는 최근 Aβ의 단일 아미노산 대체 (게시되지 않은 데이터)의 독성에 미치는 영향을 조사하기 위해이 모델의 광범위한 사용을 만들었습니다.
유전자 변형 모델은 assays에게 여기에 근육 세포 기능에 급성 Aβ 표현의 효과를 설명했다. 마비 근육 세포 및 sarcomere 시에 손상되며, 마비의 표현형 근육 세포 사망의 결과 없습니다. 그러나, 마비 후 (초기 upshift 후 ~ 48 시간) 근육 무결성 및 웜의 최종 죽음의 고장이 있습니다. 우리는 Aβ 표현이 다운 스트림 효과를 조사하거나 독성 표지로 사용하지 않았습니다.
여기에 설명된 inducible의 Aβ 표현 모델은 글 β - 아밀로이드 형성을 조절 치료를 조사에 적합하지 않습니다. 제정 Aβ 표현 양식을 쉽게 감지 아밀로이드 침전물과 함께 유전자 변형 벌레가지만 (.. 페이 외 1998; 링크 외 2001), inducible의 Aβ의 표현과 함께 유전자 변형 벌레 거의 아밀로이드 침전물이없고 마비의 표현형은 아밀로이드 증착 (드레 이크 외 독립 나타납니다. 2003). 결과는보기와 일치하는 가용성 oligomeric Aβ의 축적이 아니라 아밀로이드 증착에서 유도 Aβ 표현 결과의 급성 독성.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 프로토콜을 개발하는 데 도움 특히, 여기 원래 프로 시저를 개발 긴 폰트를 설명하는 링크 실험실의 현재와 전 회원에게 감사를 표합니다. 이 작품은 CDL에 NIH (AG12423) 및 알츠하이머 협회 (제니스 대상)에서 수상에 의해 지원되었습니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl (6g) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Agar (40g) | Sigma-Aldrich | A7002 | |
| Peptone (5g) | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| ddH2O (2L) | |||
| 1M CaCl2 (2mL) | 147.02mg/mL in ddH2O | ||
| Uracil (2mL) | 2mg/mL in ddH2O | ||
| Cholesterol (2mL) | 5mg/mL in ethanol (do not autoclave) | ||
| 1M MgSO4 (2mL) | 246.5mg/mL in ddH2O | ||
| 1M KPO4 (50mL) | 98mg KH2PO4.mL, 48mg K2HPO4/mL in ddH2O, pH | ||
| Erlenmeyer Flask | VWR international |
References
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