Testmetoder för β-amyloid toxicitet med hjälp av en transgen C. elegans Modell

Summary

Den intensivt studerade rundmasken masken

Abstract

Ackumulering av β-amyloid peptid (A-beta) är i allmänhet tros vara central för induktion av Alzheimers sjukdom, men den relevanta mekanism (er) på toxicitet är fortfarande oklart. A-beta är också deponeras intramuskulärt i Inclusion Body Myosit, en svår människa myopati. Den intensivt studerade rundmasken masken Caenorhabditis elegans kan transgenically konstruerad för att uttrycka mänskliga A-beta. Beroende på vilken vävnad eller tidpunkten för A-beta-uttryck kan transgena maskarna ha lätta att mäta fenotyper som fungerar som en avläsning av A-beta-toxicitet. Till exempel, transgena maskarna med pan-neuronala A-beta-uttrycket har fel är associativ inlärning (Dosanjh et al 2009.) Medan transgena maskarna med konstitutiva muskel-specifikt uttryck visar en progressiv, åldersberoende förlamning fenotyp (Länk, 1995; Cohen et al . 2006). Ett särskilt användbart C. elegans modell använder ett temperaturkänsligt mutation i mRNA övervakningssystem till ingenjör temperatur-inducerbara muskel uttryck för en A-beta-transgen, vilket resulterar i ett reproducerbart förlamning fenotyp på temperatur uppväxling (Link et al. 2003). Behandlingar som motverkar A-beta-toxicitet i denna modell [t.ex. uttryck för en skyddande transgen (Hassan et al. 2009) eller exponering för Ginkgo biloba extrakt (Wu et al. 2006)] reproducerbart ändra satsen av förlamning orsakas av temperatur uppväxling av dessa transgena maskar. Här beskriver vi våra protokoll för att mäta graden av förlamning i den här transgena C. elegans modell, med särskild tonvikt på experimentella variabler som kan påverka detta mått.

Protocol

1) Förbereda Nematode Tillväxt Media plattor för förlamning analysen.

Förlamning analyser utförs på vanliga medier Nematode Tillväxt (NGM) plattor som rutinmässigt används för C. elegans spridning och genetik (Stiernagle, 2006).

1. Autoklav NGM lösning som innehåller NaCl, agar och Peptone i en E-kolv och tillsätt lämplig mängd sterilt CaCl _2, uracil, kolesterol, 1M MgSO ₄ och 1M KPO _4. Alikvotera 10 ml vätska NGM i varje 60 mm x 15 mm petriskål. Låt NGM stelna över natten i rumstemperatur.
2. Om test för effekter av föreningar / extrakt, uppmätt extraktet på varje tallrik och använder en spridare att fördela utdraget över ytan av plattan. Låt extraktet torka över natten i rumstemperatur. 1 ml kommer att kräva mer tid att torka.
3. Spot varje platta med 250 mikroliter av E. coli stam OP5O odlas i LB Media natten för en optisk densitet på 0,4-0,6. Låt bakterier torka över natten i rumstemperatur.

Relevanta variabler

Åldern på plattorna har en betydande inverkan på den förlamning analysen, som äldre plattor tenderar att torka ut. Använd tallrikar hällde inom en vecka efter förlamning analysen. För bästa resultat, häll plattor 3-4 dagar innan behandling med synkrona mask populationer [se (2) nedan]. För något experiment, endast använda tallrikar strömmade från samma parti.

Ändra storleken på gräsmattan (dvs fläckig kontra spridning) och / eller vilken typ av bakterier kommer också att förändra beteendet hos de maskar. Förlamning analyser kan utföras med hjälp av alternativa E. coli-stammar som en näringskälla (t.ex. HT115 stam som används vid utfodring RNAi experiment), men detta kan ändra kinetiken av förlamning, vilket kräver lämpliga interna kontroller.

2) Förberedelse av Age-synkron Worm patientgrupper

Strain CL4176 (SMG-1 (cc546 ^ts) Jag; dvIs27 [myo-3 / A-beta minigene + rol-6 (su1006) markörgen] X är oftast används för att testmetoder för A-beta-inducerad förlamning Denna stam och andra transgena modeller finns tillgängliga. till akademiska forskare för en nominell avgift från Caenorhabditis Genetics Center (http://www.cbs.umn.edu/CGC/).

1. För att maximera ålder synkroni av testet befolkningen det är bättre att börja med en synkroniserad föräldrars generation. En vecka före inleda förlamning analys av testet befolkningen, använd en plockare platina mask för att överföra 20-30 gravid vuxna på flera 10 cm NGM plattor sprids med OP50 för en 2 timmars ägg låg på 16 ° C (de tillåtna temperaturen för CL4176 ). Ta bort gravida vuxna och låta avkomman växa i 7 dagar, då de kommer att "andra dagen" gravid vuxna.
2. (Dag 1) Den andra dagen gravid vuxna används för att förbereda en ålder-synkron testa populationer. För varje experimentell tillstånd syftet är att generera tre exemplar plattor som innehåller 50-75 års ålder-synkron maskar. Med hjälp av en platina mask plockare, överföring 10-12 på dagen 2 gravid vuxna på 60 mm (10 ml volym) NGM plattor fläckig med OP50. Låt maskarna att lägga ägg vid 16 ° C i 2 timmar, sedan plocka bort de vuxna och låta äggen att kläckas och växa vid 16 ° C. På denna punkt är det bäst att ha någon som inte kommer att göra poäng plattorna för att koda dem, så de målskytt kommer att bli blinda för experimentella förhållanden.

Relevanta variabler

Det stadium av fosterutvecklingen när äggen läggs (~ den 26-cellen scen för vild typ maskar under optimala förhållanden) är en funktion i vuxen ålder och nutrition. Om den gravida vuxna används för beredning av testet befolkningen är äldre eller svälta, kommer senare skede ägg läggas, vilket minskar ålder synkroni av befolkningen och reproducerbarhet av förlamning kinetik. Det är viktigt än mono-axenic (dvs bara OP50 bakterier) kulturer används (mikrobiella föroreningar kan allvarligt påverka detta test) och reproducerbarheten är störst om tre exemplar plattorna har liknande antal maskar.

3) Transgene Induktion och förlamning analys

1. (Dag 3) uppväxling plattor till 25 ° C 48 timmar efter utgången av den synkrona ägget låg, maskar bör vara på den tredje larvstadiet (L3). Plattor bör ordnas utan stapling i en 25 ° C inkubator så att alla plåtar för att nå 25 ° C på samma gång.
2. (Dag 4) Börja poängsättning av förlamning av maskar (stam CL4176) vid 18-20 timmar efter initiering av uppväxling. Vid det här laget bör alla maskar i populationen har nått den fjärde larver (L4) stadium. Fortsätt att göra poäng i två timmar steg tills alla maskar på varje plattorna är förlamad. Av okänd anledning är förlamning inte ens över kroppslängd: huvudet regionen är den sista delen av masken att sluta röra sig. Således, wORMS som nyligen har inlett förlamning, kan inte översätta hela plattan, men kan röra huvudet och därmed rensa bakterier runt deras främre och lämnar en "gloria" av bort bakterier. Dessa maskar kommer alltid att bli helt förlamad, och därför maskar med glorior kategoriseras som förlamad. Vissa maskar kommer inte att ha glorior men kommer också att inte visa spontana rörelser, dessa testas av petade med masken plockare. Om en stack mask inte kan genomgå en fullständig förökning vågigt vid prodding är det också protokollföras som förlamad. För effektiv scoring är det enklast att flytta förlamade maskar till en obefläckad sektor av plattan så att de inte kommer att oavsiktligt rescored nästa poäng period. (Detta gör även mis-kategoriseras maskar för att visa rörelser, vilket gör en poäng korrigering).
3. För att generera en förlamning kurva, vid varje tidpunkt andelen maskar på varje platta som inte har förlamat omvandlas till en procentsats, och den genomsnittliga "unparalyzed" andel plottas mot tiden från uppväxling invigning. (Skälet till att rita på detta sätt är att den resulterande kurvan är formellt analog med en överlevnad kurva, och därmed kan analyseras med hjälp av vanliga icke-parametrisk överlevnad statistik.)

Relevanta variabler

Den uppväxling av transgena myo-3/Aβ maskar måste ske innan de når mitten av L4 scenen för förlamning skulle inledas, eftersom myo-3 promotor är utvecklingsmässigt reglerad och har kraftigt minskat uttryck i slutet av L4 eller vuxna maskar. Likaså är uttryck för denna transgenens blockeras om maskar blir svalt, så det är viktigt att maskar är välnärda under hela försöksperioden. Vi har aldrig sett en förlamad mask att återhämta sig under alla förhållanden, och efter 12-16 tim för uppväxling kommer alla CL4176 maskar förlama, även om de är downshifted till 16 ° C. I stam CL4176, till tillräcklig uppreglering av transgens uttryck orsaka förlamning kan uppstå vid lägre temperaturer (dvs 20-25 ° C) även om tidpunkten för förlamning kommer att ändras. Den förlamning räntan beror på den specifika används transgena stam (vi har konstruerat myo-3/Aβ stammar med både snabbare och långsammare än CL4176), så med alternativa stammar göra poäng fönstret kan behöva justeras.

4) representativa resultat

Visas i figur 1 är en tomt på en förlamning kurva för CL4176, både obehandlade och utsätts för 6,27 mM koffein (slutlig koncentration i NGM plåt). Denna behandling resulterar i en mycket statistiskt signifikant förlängning förlamning av cirka 4 timmar, vilket vi tolkar som ett tecken på förtryck av A-beta-toxicitet i denna modell. Visas i figur 2 är en oberoende experiment testmetoder för effekterna av cafestol, en annan förening som finns i kaffe. Denna tomt är typiskt för behandlingar som inte påverkar A-beta-toxicitet. Observera att i båda experimenten ungefär hälften av obehandlade CL4176 populationer är förlamad i 24 timmar, och förlamning är komplett med 28 tim. Detta är typiska tidsramar för förlamning av kontroll CL4176 populationer. Väsentliga avvikelser från denna tidpunkt är ett tecken på förändrade miljöförhållanden eller spontana radering av transgen kopior. (CL4176 innehåller en kromosomalt integrerad transgen array med flera kopior av myo-3/Aβ transgenen. Även om denna transgena array är normalt ganska stabilt, all spridning av stammen vid temperaturer> 16 ° C kommer att välja för sällsynta maskar som har genomgått en spontana radering av transgener, vilket resulterar i varianter som kommer att ha minskat A-beta-uttryck och långsammare resultat förlamning.)

Figur 1. Förlamning kurva för stam CL4176 maskar obehandlat eller utsätts för 6,27 mM koffein (Sigma). Angivna tider är från initiering av temperatur uppväxling. Felstaplar = SEM

Figur 2. Förlamning kurva för CL4176 maskar som utsätts för 0,48 mM cafestol (Sigma). Felstaplar = SEM

Discussion

Protokollet har vi beskrivit effektivt kan användas för analys av effekterna av föreningar på A-beta-toxicitet. Publicerad exempel är effekterna av Ginkgo biloba extrakt beståndsdelar (Wu et al. 2006) och reserpin (Arya et al. 2009). Substanser som har skydd mot A-beta-toxicitet i andra system har också visat sig vara skyddande i denna modell (t.ex. memantin, vår opublicerade resultat). Ett viktigt motiv för att upprätta denna modell är att den väl utvecklade genetiska och molekylära verktyg som finns i C. elegans kan användas för att undersöka mekanismerna bakom A-beta-toxicitet. Därmed kan effekterna specifika mutationer på A-beta-toxicitet analyseras (t ex leder till minskad insulin-liknande signalering genom att införa en DAF-2 bortfall av funktion mutation Florez-McClure et al. 2007), och denna modell kan också användas för att undersöka effekterna av över-uttryck transgener (Fonte et al. 2008). Vi har nyligen gjort omfattande användning av denna modell för att undersöka effekterna på toxicitet enda aminosyrasubstitutioner i A-beta (opublicerade data).

De transgena modell som beskrivs här analyser effekten av akut A-beta uttryck muskelcell funktion. Vid tidpunkten för cellerna förlamning muskler och deras sarcomere är intakta, den förlamning fenotyp är inte ett resultat av muskel celldöd. Men efter förlamning (~ 48 h efter inledande uppväxling) finns en uppdelning av muskel integritet och slutligen död av maskar. Vi har inte undersökt detta nedströms effekt av A-beta-uttryck, eller använt det som ett toxicitet markör.

Den inducerbara A-beta-uttrycket modell som beskrivs här är inte lämplig för att undersöka behandlingar som modulerar β-amyloid bildas i sig. Även om transgena maskarna med konstitutivt A-beta uttrycksform lätt kan upptäckas amyloid insättningar (Fay et al 1998,.. Link et al 2001), transgena maskarna med inducerbara A-beta-uttrycket har sällan amyloid insättningar och förlamning fenotyp verkar oberoende av amyloid nedfall (Drake et al. 2003). Våra resultat överensstämmer med uppfattningen att akuta giftighet inducerad resultat A-beta-uttryck från ansamling av lösliga oligomeric A-beta, inte amyloid nedfall.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl (6g)	Sigma-Aldrich	S9888
Agar (40g)	Sigma-Aldrich	A7002
Peptone (5g)	Sigma-Aldrich	P0556
ddH2O (2L)
1M CaCl2 (2mL)			147.02mg/mL in ddH2O
Uracil (2mL)			2mg/mL in ddH2O
Cholesterol (2mL)			5mg/mL in ethanol (do not autoclave)
1M MgSO4 (2mL)			246.5mg/mL in ddH2O
1M KPO4 (50mL)			98mg KH2PO4.mL, 48mg K2HPO4/mL in ddH2O, pH
Erlenmeyer Flask	VWR international