Summary
Noi dettaglio un nuovo fluorescenza nel vicino infrarosso (NIRF) catetere per 2-dimensionale di imaging intravascolare molecolare della biologia della placca
Protocol
Nel modello animale in vivo: Generazione di aterosclerosi aortoiliaco Sperimentale
1) L'angiografia basale e denudazione Balloon
- Prima di chiedere al basale angiografia e denudazione palloncino, un coniglio bianco neozelandese è nutriti con una colesterolo alto (1%) la dieta per 1 settimana. Questo animale è utilizzato per rilevanza traslazionale come 1) la aorto-iliache navi conigli sono dello stesso calibro come umano arterie coronarie (2,5-3.5mm) e 2) l', iperlipidemici pallone-infortunio modello genera aterosclerosi infiammato cuscinetto simili cellule infiammatorie (macrofagi ) e molecole (catepsine) come l'aterosclerosi umana.
- A seguito di alimentazione colesterolo, l'animale viene anestetizzato con propofol e ketamina. Un one-inch linea mediana ventrale incisione del collo è realizzato con con una dimensione di 15-bisturi lama. Utilizzando tecniche di dissezione smussa, i muscoli sotto la fascia sul lato destro della trachea è esposto. Il muscolo sternocephalicus sinistra è divisa lungo il raccordo del tessuto connettivo, e il diritto arteria carotide comune è esposto. L'arteria è separato dal nervo vago. Anelli di sutura prossimale e distale sono immessi sul arteria per consentire retrazione e occlusione. A 1 a 2mm smussati arteriotomia è fatto attraverso il quale un 5 Francese (diametro esterno 1,67 millimetri) guaina vascolare è inserita ed eparina (1000μ/mL, ~ 150units/kg) viene somministrato intra-arteriosa attraverso la guaina.
- Mezzo di contrasto (Ultravist) viene quindi iniettato (da 1 a 2 ml) per un periodo di 2 secondi per ottenere un angiogramma controllo dell'aorta distale ed entrambe le arterie iliache.
- Le arterie e aorta ileofemorale vengono feriti da denudazione endoteliale. Utilizzando metodi di fluoroscopia standard, un catetere 3FR embolectomia di Fogarty è posizionato in arteria distale ileofemorale e gonfiato con 0,3-0,5 cc di contrasto (50% contrast/50% salina) o aria. Il catetere viene poi ritirato prossimalmente nel suo stato gonfiato a distanza lungo l'iliaca destra e l'aorta distale fino al decollo della arteria renale sinistra. Dopo la denudazione pallone, l'angiografia è ripetuto per documentare pervietà del vaso. A seguito di angiografia, guaine e tutti i cateteri vengono rimossi e il prossimale dell'arteria carotide comune è la legatura, il muscolo e fascia sono suturate con una sutura 4 / 0 riassorbibile, e l'incisione cutanea è chiuso con un 4 / 0 non riassorbibile sutura.
- L'animale è poi permesso di recuperare con la somministrazione di una dose di antibiotico (cefazolina, 0,5 grammi IM). Farmaci per il dolore tra 0,01 mg / kg IM buprenorfina (due volte al giorno se necessario). Gli animali sono poi proseguito l'1% del colesterolo per 4 settimane post-palloncino denudazione. Alla 5 ° settimana, gli animali sono passati ad una dieta colesterolo 0,3%.
Integrato multi-modale Imaging di Coniglio Atheromata
2) Etichettatura di proteoliticamente attivo placca infiammata con nanosensori iniettabili, angiografia, ecografia intravascolare (IVUS), e in vivo intravascolare NIRF immagini di Coniglio Ateroma
- Otto settimane dopo un trauma palloncino e 24 ore prima di imaging, il coniglio viene iniettato per via endovenosa con 500 nmol / kg Prosense/VM110 (PerkinElmer) tramite vena orecchio.
- Ventiquattro ore dopo l'iniezione, gli animali sono anestetizzati e l'accesso arterioso è ottenuto tramite sinistra arteria carotide comune (vedi punto 1.2). Intra-arteriosa eparina viene somministrato (150 unità / kg). Baseline angiografia è ottenuto come sopra.
- Un catetere IVUS è caricato su una clinica in grado coronarica 0,014 filo pollici e inserito nel fodero. Utilizzando guida fluoroscopica, la punta radiopaca del filo è posizionato distalmente in arteria iliaca destra. Il catetere IVUS è poi avanzato in arteria iliaca prossimale utilizzando una tecnica standard clinico monorotaia.
- A 100 pullback mm è iniziato e le immagini vengono registrate. Ricostruzione longitudinale della nave si ottiene e placca luminale è identificato.
- Il catetere NIRF 11,12 viene caricato sul filo di 0,014 pollici (monorotaia sistema) e il catetere viene accuratamente inserito nella guaina e la testa di imaging è posizionato distalmente in arteria iliaca destra.
- Multipli pullbacks automatizzati (1 mm / sec pullback longitudinale, 30 colpi al minuto) sono eseguite e segnali di fluorescenza all'interno delle zone di aterosclerosi sono noti. Le immagini vengono registrate e il successivo trattamento con scala appropriata e finestre a seconda della distanza del segnale viene raggiunto.
3) L'eutanasia e l'isolamento di ex vivo aorto-iliaca del tessuto
- L'eutanasia è compiuta con 1cc di agente eutanasia (soluzione di 390mg di sodio fenitoina sodio pentobarbital e 50 mg), per via endovenosa, iniezione singola.
- L'albero arterioso è perfuso con soluzione fisiologica 0,9% fino alla vena cava inferiore è chiaro di sangue. Aterosclerotica delle arterie aorta e iliache sono identificati e sezionati libero dai tessuti circostanti. Inoltre, piccoli pezzi di 2 x 2 cm di liver, rene, milza e cuore sono anche ottenuti.
- Ex vivo NIRF imaging con il catetere intravascolare NIRF immagini può essere fatto in questa fase. La nave è allungata e il catetere NIRF è reinserito in aorta prossimale fino a quando la testa di imaging è posizionato a livello dell'arteria iliaca destra o di biforcazione. Multipli pullbacks automatici vengono eseguiti come sopra (vedi 2.6).
4) ex vivo fluorescenza Riflettanza Imaging (FRI) di aorta e le arterie iliache sezionato
- Tessuto sezionato viene inserito in 10-20 cc di soluzione fisiologica e trasportati per le analisi ven (Kodak Image Stazione 4000MM Pro, Carestream Health, Inc.).
- Aorta, vasi iliaci sono allungate per approssimare in tempo reale lunghezze e le immagini sono ottenute a più lunghezze d'onda [luce bianca, canale verde fluorescente (ex 495 nm, em 515 nm), Cy5 (ex 565 nm, em 670 nm) e Cy7 (ex 650 nm, em 760 nm)] canali. Una serie di tempi di esposizione sono utilizzati per ogni lunghezza d'onda (0.1-30sec) e le immagini acquisite vengono esportati come DICOM o 16-bit TIFF i file non in scala per ulteriori analisi. Come controlli positivi e negativi, organi (fegato, milza, rene e cuore) sono esposte a canali simili e tempi di esposizione.
- Aree di segnale aumentato nel vicino infrarosso canale (780nm +) sono noti aterosclerotiche nelle arterie.
5) Integrazione del tessuto per l'analisi Sezioni e immunoistochimica
- Aree di normale (non feriti tessuto, cioè l'arteria iliaca sinistra) e le aree di placca sono identificati e piccoli anelli di 5-10 mm di tessuto sono incorporati in ottobre (temperatura di taglio ottimale) dei media. I blocchi sono conservati a -80 C fino al sezionamento.
- Le tecniche standard per le analisi immunoistochimiche e di sezionamento vengono eseguite. Ematossilina ed eosina, Ram-11 e catepsina B colorazione vengono eseguite.
Analisi e integrazione di immagini multimodali (angiografia, IVUS, NIRF e ven.)
6) Elaborazione di immagini NIRF e VEN
- File DICOM contenenti dati di immagini da NIRF e VEN (prese al vicino canale dell'infrarosso da 780 nm) pullback sono trattati con MATLAB e software OsiriX, rispettivamente. Windowing corretto per visualizzare gamma completa di intensità del segnale è ottenuto. Immagini finali sono esportati come file TIFF.
- I file vengono importati nel software standard di elaborazione delle immagini (Keynote può essere utilizzato). Le immagini sono allineati sulla base di punti di riferimento (cioè vertebre su angiogramma, biforcazione iliaca, e dell'arteria renale). Aree di nave normale e placca sono identificati.
- Regioni di interesse (ROI) sono tracciate manualmente (per il tessuto normale e aree di placca) e media intensità di segnale sono acquisite con OsiriX e MATLAB, rispettivamente, sia per ven e immagini NIRF. Per guida appropriata tracciamento, l'immagine IVUS longitudinale della nave viene utilizzato e l'identificazione della nave normale e targa sono facilmente identificabili.
- Obiettivo da sfondo (TBR) rapporti sono calcolati per le zone della placca.
Rappresentante dei risultati:
Al termine del protocollo di cui sopra, siamo in grado di identificare e caratterizzare le aree di attività aumentata della proteasi catepsina nella placca infiammatoria all'interno della aorta e vasi iliaci. L'iniezione di un nanosensore attivabili (Prosense/VM110) ci permette di identificare la placca proteoliticamente attivo. Questi appaiono come segnali luminosi o zone di intensa quando ripreso utilizzando ven nel canale vicino infrarosso (750 nm). Il pullback NIRF correlazione con l'intensità del segnale è aumentato del venerdì e allineamenti con IVUS anatomiche che permettono di registrazione dei segnali NIRF. TBR targa calcolato è ottenuto da venerdì e NIRF erano simili (vedi Figura 3: media NIRF TBR 4.2, significa ven TBR 2,9). Analisi immunoistochimica della placca luminosa conferma la presenza intensa di RAM-11 e l'attività della catepsina B in aree di placca (dati non riportati).
Figura 1. Schematica del catetere 2D NIRF Per estendere il potenziale clinico di un approccio 1D NIRF rilevamento 6, abbiamo costruito un romanzo in 2-D NIRF-catetere per l'imaging intravascolare. 11,12 La fuoriserie catetere è costituito da una fibra ottica (125 micron di diametro alloggiati in tubo di polietilene: 2.9F), che illumina con una sorgente laser a 750 nm di eccitazione. La luce laser è emessa ad un angolo di 90 gradi rispetto all'asse della fibra. Il sistema utilizza due motori automatici (rotazionale e traslazionale) per consentire la concomitante immagini a 360 gradi e pullback longitudinale per ottenere vere immagini 2D. Le immagini utilizzate con il permesso di riferimento 11.
Figura 2. Schematico dimostrando proteasi-mediata attivazione dei nanosensori, Prosense/VM110. Immagine usata con il permesso di riferimento 10.
Figura 3. In vivo ed ex TBRs placca in vivo (target a rapporti di sfondo)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Infiammata placche ad alto rischio o vulnerabili sono probabilmente responsabili della maggior parte degli infarti del miocardio. L'identificazione delle targhe precedenti l'inizio dei sintomi ha importanti implicazioni cliniche, sia nel predire gli esiti e guidare la terapia medica. Tradizionali modalità di imaging delle arterie coronariche, come l'angiografia a raggi X in genere si concentrano sulla caratterizzazione dei restringimenti del lume, piuttosto che illumina i profili biologici sottostanti ad alto rischio, di solito non le lesioni stenotiche. Intravascolare NIRF imaging molecolare offre un approccio cardiaco laboratorio di cateterizzazione traducibile che incorpora la biologia di infiammazione della placca utilizzando nanosensori che identificano i macrofagi attiva all'interno della placca, una caratteristica cellulare di una placca infiammata facilmente rompersi 9.
Il seguente protocollo di cui sopra utilizza un approccio multimodale che combina integrativo angiografia, IVUS e NIRF immagini per identificare la placca infiammata. Questo romanzo 2D catetere NIRF sfrutta le proprietà ottiche favorevole del vicino infrarosso per rilevare la larghezza di banda di fluorescenza firme molecolari attraverso il sangue, ed è un promettente approccio in vivo per l'imaging molecolare. Il Prosense/VM110 nanosensori è accoppiato a fluorocromi che emettono fluroescence a 780 nm e utilizzano l'auto-spegnimento, in assenza di taglio proteolitico o l'attivazione dell'enzima catepsina dalla B (altamente espresso nei macrofagi residenti). Rilevamento in vivo segnale di fluorescenza da parte del catetere NIRF permette l'identificazione di macrofagi carichi di placca (TBR 2,9). L'utilizzo di ex vivo fluorescenza di riflessione per immagini (FRI) conferma la presenza di segnale NIR fluorescenza all'interno delle aree di placca (TBR 4.2). Colorazione immunoistochimica di RAM-11 e catepsina nelle aree della placca confermano l'intensa infiltrazione di catepsina B-macrofagi positivi (dati non riportati).
L'incorporazione di IVUS e segnale NIRF possono essere fusi mappa di intensità del segnale all'interno della placca visibile per tutta la lunghezza della nave (dati non riportati) e offre un'opportunità unica per chiarire ulteriormente la morfologia luminale della placca e del contenuto dei macrofagi. Attuali limiti della tecnica sopra includere l'impossibilità di esattamente co-registrare la IVUS e pullbacks NIRF. Pullback simultanea tramite un integrato dual-modale catetere aumenterebbe la precisione della localizzazione del segnale e, potenzialmente, abilitare la risoluzione della posizione del segnale all'interno della parete dei vasi (cioè la profondità del segnale all'interno del lume, media, o avventizia). Doppio modale NIRF / IVUS o NIRF / tomografia a coerenza ottica (OCT) cateteri fusione sono previste, pertanto di fornire ulteriori delineazione di segnale e di integrare l'architettura placca con la biologia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
FAJ - Consulente Ex, VisEn medica; onorari, Boston Scientific
Acknowledgments
Il supporto per questo lavoro è stato fornito dal National Institutes of Health concedere R01 # 108229 HL, American Heart Association Scientist Development Grant # 0830352N, Howard Hughes Medical Institute Career Development Award, Ventures Broadview, Settimo programma quadro della Comunità europea (FP7/2007-2013 in borsa accordo # 235689), e il MGH William Schreyer Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prosense 750 | Visen Medical | VM110 | 500 nmol/kg IV injection |
| Heparin Sodium | APP Pharmaceuticals | 401586D | |
| Cephazolin | NovaPlus | 46015683 | |
| Lidocaine HCL 2% | Hospira Inc. | NDC 0409-4277-01 | |
| Buprenorphine | Bedford Laboratories | NDC 55390-100-10 | |
| Ketamine | Hospira Inc. | NDC 0409-2051-05 | |
| High Cholesterol Diet 1% | Research Diets | C30293 | |
| HIgh Cholesterol Diet 0.3% | Research Diets | C30255 |
References
- Andersson, J., Libby, P. Adaptive immunity and atherosclerosis. Clin Immunol. 134, 33-46 (2010).
- Calfon, M. A., Vinegoni, C. Intravascular near-infrared fluorescence molecular imaging of atherosclerosis: toward coronary arterial visualization of biologically high-risk plaques. Journal of Biomedical Optics. 15, 011107-011107 (2010).
- Chen, J., Tung, C. -H. In Vivo Imaging of Proteolytic Activity in Atherosclerosis. Circulation. 105, 2766-2771 (2002).
- Jaffer, F. A., Libby, P. Molecular Imaging of Cardiovascular Disease. Circulation. 116, 1052-1061 (2007).
- Jaffer, F. A., Libby, P. Optical and Multimodality Molecular Imaging: Insights Into Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29, 1017-1024 (2009).
- Jaffer, F. A., Vinegoni, C. Real-Time Catheter Molecular Sensing of Inflammation in Proteolytically Active Atherosclerosis. Circulation. 118, 1802-1809 (2008).
- Kim, D. -E., Kim, J. -Y. Protease Imaging of Human Atheromata Captures Molecular Information of Atherosclerosis, Complementing Anatomic Imaging. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 449-456 (2010).
- Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420, 868-874 (2002).
- Naghavi, M., Libby, P. From Vulnerable Plaque to Vulnerable Patient: A Call for New Definitions and Risk Assessment Strategies: Part I. Circulation. 108, 1664-1672 (2003).
- Weissleder, R., Tung, C. -H. In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotech. 17, 375-375 (1999).
- Razansky, R. N., Rosenthal, A. Near-infrared fluorescence catheter system for two-dimensional intravascular imaging in vivo. Optics Express. 18, 11372-11381 (2010).
- Jaffer, F. A., Calfon, M. A. Two-Dimensional Intravascular Near-Infrared Fluorescence Molecular Imaging of Inflammation in Atherosclerosis and Stent-Induced Vascular Injury. Journal of the American College of Cardiology. 57, 2516-2526 (2011).
