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Atherosclerosis की इमेजिंग इन्फ्रारेड प्रतिदीप्ति फलक भड़काऊ (NIRF) intravascular आण्विक इमेजिंग, एक मल्टीमॉडल दृष्टिकोण के पास vivo में

doi: 10.3791/2257 Published: August 4, 2011

Summary

पट्टिका जीव विज्ञान के 2 - आयामी intravascular आणविक इमेजिंग के लिए हम एक नई निकट अवरक्त प्रतिदीप्ति कैथेटर (NIRF) का विस्तार

Protocol

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प्रायोगिक AortoIliac Atherosclerosis की पीढ़ी vivo पशु मॉडल में:

1) बेसलाइन एंजियोग्राफी और गुब्बारा अनाच्छादन

  1. आधारभूत एंजियोग्राफी और गुब्बारे अनाच्छादन प्राप्त करने के लिए पहले, न्यूजीलैंड सफेद खरगोश एक उच्च कोलेस्ट्रॉल (1%) 1 सप्ताह के लिए आहार खिलाया है. इस जानवर को 1 के रूप में translational प्रासंगिकता के लिए उपयोग किया जाता है) खरगोशों में aorto iliacs जहाजों मानव कोरोनरी धमनियों (2.5-3.5mm) और 2) के रूप में एक ही क्षमता hyperlipidemic, मॉडल गुब्बारा चोट सूजन atherosclerosis के इसी तरह भड़काऊ कोशिकाओं (मेक्रोफेज असर उत्पन्न कर रहे हैं ) और के रूप में मानव atherosclerosis में अणुओं (cathepsins).
  2. कोलेस्ट्रॉल खिलाने के बाद, पशु propofol और ketamine के साथ anesthetized है. एक एक इंच वेंट्रल midline गर्दन चीरा 15 स्केलपेल आकार ब्लेड का उपयोग कर का उपयोग किया है. कुंद विच्छेदन तकनीकों का प्रयोग, ट्रेकिआ के सही पक्ष पर प्रावरणी के नीचे मांसपेशियों को अवगत कराया है. बाईं sternocephalicus मांसपेशियों अपने संयोजी ऊतक जंक्शन के साथ अलग है, और सही आम मन्या धमनी अवगत कराया है. धमनी vagus नसों से अलग है. समीपस्थ और बाहर का सिवनी loops धमनी पर रखा जाता है त्याग और रोड़ा लिए अनुमति. एक एक 2mm arteriotomy beveled किया जाता है जिसके माध्यम से एक 5 फ्रांसीसी (बाहरी 1.67mm व्यास) संवहनी म्यान डाला है और हेपरिन (1000μ/mL, 150units/kg ~) म्यान के माध्यम से अंतर arterially प्रशासित.
  3. कंट्रास्ट डाई (Ultravist) तो एक 2 दूसरा बाहर का महाधमनी के एक नियंत्रण एंजियोग्राम और दोनों श्रोणिफलक धमनियों प्राप्त करने की अवधि में अंतःक्षिप्त है (1 के लिए 2ml).
  4. iliofemoral धमनियों और महाधमनी तो endothelial अनाच्छादन से घायल हैं. मानक प्रतिदीप्तिदर्शन विधियों का प्रयोग, एक 3Fr Fogarty embolectomy कैथेटर बाहर का iliofemoral धमनी में रखा गया है और इसके विपरीत के 0,3 करने के लिए 0,5 सीसी की (50% contrast/50% खारा) या हवा के साथ फुलाया. कैथेटर तो अपने फुलाया राज्य में proximally सही श्रोणिफलक और बाहर का महाधमनी के साथ एक बाएँ गुर्दे की धमनी की दूरी से दूर ले वापस ले लिया. गुब्बारा अनाच्छादन के बाद, एंजियोग्राफी पोत प्रत्यक्षता दस्तावेज़ दोहराया है. एंजियोग्राफी के बाद, सभी कैथेटर और sheaths को हटा रहे हैं और प्रॉक्सिमल सही आम मन्या धमनी ligated है, मांसपेशियों और प्रावरणी एक 4 / 0 absorbable सीवन के साथ sutured हैं, और त्वचा चीरा एक 4 / 0 गैर absorbable सीवन के साथ बंद हुआ.
  5. जानवर तो एक खुराक एंटीबायोटिक दवाओं (Cephazolin, 0.5 ग्राम आईएम) के प्रशासन के साथ ठीक करने की अनुमति दी है. 0.01 मिलीग्राम / किग्रा buprenorphine आईएम (एक दिन में दो बार के रूप में की जरूरत) सहित दर्द दवाओं. पशु तो 4 सप्ताह के बाद गुब्बारा अनाच्छादन के लिए 1% कोलेस्ट्रॉल पर जारी हैं. 5 सप्ताह में, पशुओं 0.3% कोलेस्ट्रॉल आहार के लिए transitioned हैं.

खरगोश Atheromata के एकीकृत इमेजिंग मल्टी मोडल

2 proteolytically सक्रिय सूजन इंजेक्शन nanosensor का उपयोग पट्टिका के) लेबल, एंजियोग्राफी, intravascular अल्ट्रासाउंड (IVUS), और vivo में खरगोश Atheroma के intravascular NIRF इमेजिंग में

  1. गुब्बारा चोट और इमेजिंग के लिए पहले 24 घंटे के बाद आठ सप्ताह, खरगोश नसों में 500 nmol / किलो Prosense/VM110 (PerkinElmer) के साथ कान की नस के माध्यम से इंजेक्शन है.
  2. इंजेक्शन के बाद चौबीस घंटे, जानवरों anesthetized और धमनियों का उपयोग बाईं आम मन्या धमनी के माध्यम से प्राप्त की है (1.2 कदम देखें) कर रहे हैं. इंट्रा - धमनी हेपरिन (150 इकाइयों / किलो) प्रशासित है. बेसलाइन एंजियोग्राफी इसके बाद के संस्करण के रूप में प्राप्त होता है.
  3. एक IVUS कैथेटर एक नैदानिक ​​कोरोनरी धमनी सक्षम 0.014 इंच तार पर लादा है और म्यान में डाला. Fluoroscopic मार्गदर्शन का प्रयोग, तार के radiopaque टिप distally सही श्रोणिफलक धमनी में तैनात है. IVUS कैथेटर तो प्रॉक्सिमल श्रोणिफलक धमनी में एक मानक नैदानिक ​​मोनोरेल तकनीक का उपयोग कर उन्नत है.
  4. एक 100 मिमी pullback के शुरू और छवियों दर्ज हैं. पोत के अनुदैर्ध्य पुनर्निर्माण प्राप्त है और luminal पट्टिका की पहचान की है.
  5. NIRF 11,12 कैथेटर 0.014 इंच तार (मोनोरेल प्रणाली) पर भरी हुई है, और कैथेटर सावधानी म्यान में डाला जाता है और इमेजिंग सिर distally सही श्रोणिफलक धमनी में तैनात है .
  6. एकाधिक स्वचालित pullbacks (1 मिमी / सेकंड अनुदैर्ध्य pullback, प्रति मिनट 30 राउंड) प्रदर्शन और atherosclerosis के क्षेत्रों के भीतर प्रतिदीप्ति संकेतों नोट कर रहे हैं. छवियाँ दर्ज कर रहे हैं और उचित स्केलिंग और गवाक्षन संकेत की सीमा के आधार पर के साथ आगे प्रसंस्करण हासिल की है.

3) इच्छामृत्यु और पूर्व vivo aorto-श्रोणिफलक ऊतक के अलगाव

  1. इच्छामृत्यु 1cc इच्छामृत्यु एजेंट (390mg सोडियम pentobarbital और 50mg फ़िनाइटोइन सोडियम के समाधान), नसों, एक इंजेक्शन के साथ पूरा किया है.
  2. धमनी पेड़ 0.9% सामान्य नमक के साथ perfused है जब तक अवर रग Cava खून की स्पष्ट है. atherosclerotic महाधमनी और श्रोणिफलक धमनियों की पहचान कर रहे हैं और आसपास के ऊतकों से मुक्त dissected. इसके अलावा, ली के छोटे 2 एक्स 2 सेमी टुकड़ेदेखें, गुर्दा, तिल्ली, और दिल भी प्राप्त कर रहे हैं.
  3. पूर्व vivo NIRF इमेजिंग intravascular NIRF इमेजिंग कैथेटर के साथ इस स्तर पर किया जा सकता है . पोत लम्बी है और NIRF कैथेटर है प्रॉक्सिमल महाधमनी में फिर से डाला जब तक इमेजिंग सिर सही श्रोणिफलक धमनी या विभाजन पर तैनात है. एकाधिक स्वचालित pullbacks ऊपर के रूप में प्रदर्शन कर रहे हैं (2.6 देखें).

4) पूर्व vivo में dissected महाधमनी और श्रोणिफलक धमनियों के प्रतिदीप्ति reflectance इमेजिंग (शुक्र)

  1. Dissected ऊतक सामान्य नमक की 10-20 सीसी में रखा गया है और शुक्र (Kodak छवि स्टेशन 4000mm प्रो, Carestream स्वास्थ्य इंक) विश्लेषण के लिए पहुँचाया.
  2. महाधमनी, श्रोणिफलक वाहिकाओं लगभग वास्तविक समय की लंबाई करने के लिए लम्बी हैं और छवियों एकाधिक तरंगदैर्य [श्वेत प्रकाश, हरे रंग का फ्लोरोसेंट चैनल (पूर्व 495 एनएम, उन्हें 515 एनएम), Cy5 (पूर्व 565 एनएम, उन्हें 670 एनएम) और Cy7 (पूर्व में प्राप्त कर रहे हैं 650 एनएम, उन्हें 760 एनएम)] चैनलों. जोखिम बार की एक श्रृंखला के प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए उपयोग किया जाता है (0.1 - 30sec) और अधिग्रहीत छवियों DICOM या आगे के विश्लेषण के लिए 16-bit unscaled झगड़ा फ़ाइलों के रूप में निर्यात कर रहे हैं. सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, अंगों (यकृत, प्लीहा, गुर्दे और दिल) इसी तरह के चैनलों और जोखिम बार में imaged हैं.
  3. लगभग अवरक्त चैनल (780nm +) में वृद्धि संकेत के क्षेत्रों atherosclerotic धमनियों में नोट कर रहे हैं.

5) सेक्शनिंग और immunohistochemical विश्लेषण के लिए ऊतक एम्बेडिंग

  1. सामान्य क्षेत्रों (गैर घायल ऊतक, यानी बाएँ श्रोणिफलक धमनी) और पट्टिका के क्षेत्रों की पहचान कर रहे हैं और छोटे ऊतक के 5-10 मिमी छल्ले अक्टूबर मीडिया (इष्टतम काटना तापमान) में एम्बेडेड रहे हैं. ब्लॉक -80 सी सेक्शनिंग जब तक जमा कर रहे हैं.
  2. सेक्शनिंग और immunohistochemical विश्लेषण के लिए मानक तकनीक का प्रदर्शन कर रहे हैं. Hematoxylin और eosin दाग, राम-11 और cathepsin बी धुंधला प्रदर्शन कर रहे हैं.

विश्लेषण और बहु ​​modal छवियाँ की एकता (एंजियोग्राफी, IVUS, NIRF और शुक्र)

6) NIRF और शुक्र छवियों का प्रसंस्करण

  1. DICOM इमेजिंग डेटा NIRF और शुक्र से युक्त फ़ाइलों (निकट अवरक्त 780 एनएम चैनल पर लिया) pullbacks MATLAB और Osirix सॉफ्टवेयर का उपयोग संसाधित कर रहे हैं, क्रमशः. उचित करने के लिए संकेत तीव्रता की पूरी रेंज प्रदर्शित गवाक्षन हासिल की है. अंतिम छवियों झगड़ा फ़ाइलों के रूप में निर्यात कर रहे हैं.
  2. मानक छवि संसाधन सॉफ्टवेयर (मुख्य वक्ता के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है) में फ़ाइलें आयात कर रहे हैं. छवियाँ संदर्भ बिंदु (यानी कशेरुकाओं एंजियोग्राम, श्रोणिफलक विभाजन, और गुर्दे की धमनी पर) पर आधारित गठबंधन कर रहे हैं. सामान्य पोत और पट्टिका के क्षेत्रों की पहचान कर रहे हैं.
  3. मैन्युअल रूप से ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र (सामान्य और पट्टिका के ऊतकों के क्षेत्रों के लिए) का पता लगाया जा रहे हैं और मतलब संकेत तीव्रता Osirix और MATLAB का उपयोग करके प्राप्त कर रहे हैं, दोनों शुक्र और NIRF छवियों के लिए क्रमशः. उपयुक्त अनुरेखण मार्गदर्शन करने के लिए, पोत के अनुदैर्ध्य IVUS छवि का इस्तेमाल किया है और सामान्य पोत और पट्टिका की पहचान आसानी से पहचाने जाते हैं.
  4. पृष्ठभूमि अनुपात (TBR) लक्ष्य को पट्टिका क्षेत्रों के लिए गणना कर रहे हैं.

प्रतिनिधि परिणाम:

ऊपर प्रोटोकॉल के पूरा होने पर, हम की पहचान करने और भड़काऊ पट्टिका में महाधमनी और श्रोणिफलक वाहिकाओं के भीतर संवर्धित cathepsin protease गतिविधि के क्षेत्रों को चिह्नित कर सकते हैं. एक activatable nanosensor (Prosense/VM110) इंजेक्शन हमें proteolytically सक्रिय पट्टिका की पहचान करने के लिए अनुमति देता है. ये उज्ज्वल के रूप में दिखाई देते हैं या तीव्र क्षेत्रों संकेत जब निकट अवरक्त चैनल (750 एनएम) में शुक्र का उपयोग करने imaged. NIRF pullbacks शुक्र संकेत तीव्रता में वृद्धि और IVUS जो संरचनात्मक NIRF संकेतों के पंजीकरण की अनुमति के साथ संरेखण के साथ सहसंबंधी. परिकलित पट्टिका TBR शुक्र और NIRF से प्राप्त समान थे (चित्रा 3 देखें: NIRF TBR 4.2 मतलब, मतलब शुक्र TBR 2.9). उज्ज्वल पट्टिका का immunohistochemical विश्लेषण रैम-11 और पट्टिका के क्षेत्रों (नहीं दिखाया डेटा है) में cathepsin बी गतिविधि के तीव्र उपस्थिति की पुष्टि करता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. योजनाबद्ध 2D NIRF कैथेटर के एक 1D NIRF संवेदन 6 दृष्टिकोण के नैदानिक ​​क्षमता का विस्तार करने के लिए, हम एक उपन्यास 2-D intravascular इमेजिंग के लिए NIRF - कैथेटर का निर्माण किया. 11,12 कैथेटर कस्टम निर्मित एक ऑप्टिकल फाइबर ( 125 माइक्रोन व्यास रखे होते हैं पॉलीथीन टयूबिंग में: 2.9F) है कि एक 750 एनएम लेजर उत्तेजना स्रोत का उपयोग illuminates. लेजर प्रकाश एक 90 डिग्री के कोण फाइबर अक्ष के सापेक्ष में उत्सर्जित होता है. प्रणाली दो स्वचालित मोटर्स (घूर्णी और translational) का इस्तेमाल करने के लिए सहवर्ती 360 डिग्री इमेजिंग और अनुदैर्ध्य pullback के सक्षम करने के लिए सच इमेजिंग 2 डी प्राप्त है. छवियाँ 11 संदर्भ से अनुमति के साथ इस्तेमाल किया.

चित्रा 2
चित्रा 2. योजनाबद्ध nanosensor प्रदर्शन का सक्रियण protease मध्यस्थता, Prosense/VM110. 10 संदर्भ से अनुमति के साथ इस्तेमाल किया छवि.

तालिका 1 चित्रा 3. Vivo और पूर्व vivo फलक TBRs (पृष्ठभूमि के अनुपात लक्ष्य)

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Discussion

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सूजन उच्च जोखिम या कमजोर सजीले टुकड़े की संभावना दौरे infarctions के बहुमत के लिए जिम्मेदार हैं. लक्षणों की शुरुआत से पहले इस तरह के सजीले टुकड़े की पहचान दोनों परिणामों की भविष्यवाणी और चिकित्सा उपचार के मार्गदर्शन में महत्वपूर्ण नैदानिक ​​निहितार्थ है. एक्स - रे एंजियोग्राफी जैसे परम्परागत कोरोनरी धमनी इमेजिंग रूपात्मकता luminal narrowings के लक्षण वर्णन के बजाय उच्च जोखिम है, आमतौर पर गैर stenotic घावों की अंतर्निहित जैविक प्रोफाइल रोशन पर आम तौर पर ध्यान केंद्रित. Intravascular NIRF आणविक इमेजिंग एक कार्डियक कैथीटेराइजेशन प्रयोगशाला अनुवाद दृष्टिकोण है कि nanosensors कि पट्टिका के भीतर सक्रिय मैक्रोफेज की पहचान का उपयोग करके पट्टिका सूजन के जीव विज्ञान को शामिल किया, एक सूजन पट्टिका का एक सेलुलर बानगी टूटना करने के लिए प्रवण प्रदान करता है 9.

ऊपर उल्लिखित निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक बहुविध एकीकृत दृष्टिकोण एंजियोग्राफी, IVUS और NIRF इमेजिंग के संयोजन सूजन पट्टिका की पहचान इस्तेमाल. इस उपन्यास 2D NIRF कैथेटर लगभग अवरक्त प्रतिदीप्ति बैंडविड्थ के अनुकूल ऑप्टिकल गुणों पर capitalizes के लिए रक्त के माध्यम से आणविक हस्ताक्षर का पता लगाने, और vivo में आणविक इमेजिंग के लिए दृष्टिकोण में एक वादा किया है. nanosensor Prosense/VM110 fluorochromes है कि 780 एनएम fluroescence फेंकना और एंजाइम cathepsin बी (अत्यधिक निवासी मैक्रोफेज में व्यक्त) द्वारा proteolytic दरार या सक्रियण के अभाव में ऑटो शमन का उपयोग करने के लिए युग्मित है. NIRF कैथेटर द्वारा vivo प्रतिदीप्ति संकेत में की जांच बृहतभक्षककोशिका से लदी पट्टिका की पहचान (2.9 TBR) की अनुमति देता है. पूर्व vivo प्रतिदीप्ति reflectance इमेजिंग (शुक्र) का उपयोग पट्टिका के क्षेत्रों (4.2 TBR) के भीतर NIR प्रतिदीप्ति संकेत की उपस्थिति की पुष्टि करता है . पट्टिका के क्षेत्रों के भीतर 11-रैम और cathepsin immunohistochemical cathepsin बी सकारात्मक मैक्रोफेज (नहीं दिखाया डेटा) की तीव्र घुसपैठ की पुष्टि धुंधला हो जाना.

IVUS और NIRF संकेत का समावेश दिखाई पट्टिका के भीतर नक्शा संकेत तीव्रता इनकार किया जा सकता है और पोत (नहीं दिखाया डेटा है) की लंबाई के साथ आगे luminal पट्टिका आकारिकी और बृहतभक्षककोशिका सामग्री को स्पष्ट करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है. उपरोक्त तकनीक के वर्तमान सीमाओं बिल्कुल IVUS और NIRF pullbacks सह रजिस्टर में असमर्थता शामिल हैं. एक एकीकृत दोहरे मोडल कैथेटर के माध्यम से एक साथ pullback के संकेत स्थान की सटीकता को बढ़ाने के लिए और संभावित संकेत के पोत दीवार (लुमेन के भीतर यानी संकेत के गहराई, मीडिया, या adventitia) के भीतर स्थान का संकल्प सक्षम होगा. दोहरी मोडल NIRF / IVUS या / NIRF ऑप्टिकल जुटना tomography (अक्टूबर) संलयन कैथेटर इसलिए प्रत्याशित रहे हैं संकेत के आगे चित्रण प्रदान और जीव विज्ञान के साथ पट्टिका वास्तुकला शामिल है.

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Disclosures

मानदेय, बोस्टन वैज्ञानिक, पूर्व सलाहकार, VisEn चिकित्सा - FAJ

Acknowledgments

इस काम के लिए स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थन प्रदान किया गया # R01 HL 108229, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन वैज्ञानिक विकास 0830352N # अनुदान, हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट कैरियर विकास पुरस्कार, Broadview वेंचर्स, यूरोपीय समुदाय सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013 अनुदान के तहत 235689 # समझौते), और MGH विलियम Schreyer फैलोशिप.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Prosense 750 Visen Medical VM110 500 nmol/kg IV injection
Heparin Sodium APP Pharmaceuticals 401586D
Cephazolin NovaPlus 46015683
Lidocaine HCL 2% Hospira Inc. NDC 0409-4277-01
Buprenorphine Bedford Laboratories NDC 55390-100-10
Ketamine Hospira Inc. NDC 0409-2051-05
High Cholesterol Diet 1% Research Diets C30293
HIgh Cholesterol Diet 0.3% Research Diets C30255

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References

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Atherosclerosis की इमेजिंग इन्फ्रारेड प्रतिदीप्ति फलक भड़काऊ (NIRF) intravascular आण्विक इमेजिंग, एक मल्टीमॉडल दृष्टिकोण के <em>पास vivo</em> में
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Calfon, M. A., Rosenthal, A., Mallas, G., Mauskapf, A., Nudelman, R. N., Ntziachristos, V., Jaffer, F. A. In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis. J. Vis. Exp. (54), e2257, doi:10.3791/2257 (2011).More

Calfon, M. A., Rosenthal, A., Mallas, G., Mauskapf, A., Nudelman, R. N., Ntziachristos, V., Jaffer, F. A. In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis. J. Vis. Exp. (54), e2257, doi:10.3791/2257 (2011).

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