Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravaskulär Molecular Imaging av inflammatoriska plack, en multimodal metod för avbildning av åderförkalkning

doi: 10.3791/2257 Published: August 4, 2011

Summary

Vi detalj ett nytt nära infraröda fluorescens (NIRF) kateter för 2-dimensionella intravaskulär molekylär bildanalys av plack biologi

Abstract

Den vaskulära svaret på skadan är en väl iscensatt inflammatorisk reaktion utlöst av ansamling av makrofager i kärlväggen vilket leder till en ansamling av lipid-lastat inom luminala plack, glatt muskulatur celltillväxt och progressivt minska fartygets lumen. Bildandet av sådana sårbara plack benägenhet att brista ligger bakom de flesta fall av akut hjärtinfarkt. Det komplexa molekylära och cellulära inflammatoriska kaskaden är iscensatt av rekrytering av T-lymfocyter och makrofager och deras parakrina effekter på endotelceller och glatta muskelceller. 1

Molecular imaging i ateroskleros har utvecklats till en viktig klinisk och forskning verktyg som möjliggör in vivo visualisering av inflammation och andra biologiska processer. Flera aktuella exempel visa förmåga att upptäcka hög risk plack hos patienter, och bedöma effekterna av pharmacotherapeutics i åderförkalkning. 4 Även om flera av molekylär bildanalys metoder (särskilt MRI och PET) kan bild biologiska aspekterna av stora fartyg som halspulsådern artärer, knappa alternativ finns för avbildning av kranskärl. 2 Tillkomsten av högupplösande optisk avbildning strategier, särskilt nära infraröda fluorescens (NIRF), i kombination med som aktiveras fluorescerande prober, har förbättrat känslighet och ledde till utvecklingen av nya intravaskulär strategier att förbättra biologisk avbildning av mänskliga koronar ateroskleros.

Nära infraröd fluorescens (NIRF) molecular imaging använder excitation ljus med en bestämd bandbredd (650-900 nm) som en källa till fotoner som, när de levereras till en optisk kontrastmedel eller fluorescerande probe avger fluorescens i NIR fönster som kan upptäckas med en lämplig utsläpp filter och en hög känslighet charge-coupled kamera. Till skillnad från synligt ljus, tränger NIR ljus djupt i vävnaden, är klart mindre dämpats endogena fotonen absorbenter som hemoglobin, lipid och vatten, och möjliggör höga mål till bakgrunden nyckeltal på grund av minskad autofluorescens i NIR-fönster. Imaging inom NIR "fönstret" kan avsevärt förbättra möjligheterna för in vivo imaging. 2,5

Inflammatoriska cysteinproteaser har väl studerat med som aktiveras NIRF sonder 10, och spelar en viktig roll i aterogenesen. Via nedbrytning av extracellulär matrix, cysteinproteaser bidrar allt till progression och komplikationer av ateroskleros 8. I synnerhet är det cystein proteas, cathepsin B, mycket uttrycks och colocalizes med makrofager i experimentell murina, kanin och människa atheromata. 3,6,7 Dessutom kan cathepsin B aktivitet i plack kännas in vivo att använda en tidigare beskrivits en -D intravaskulära nära infraröda fluorescens-teknik 6, i samband med ett injicerbart Nanosensorn agent som består av en poly-lysin polymer ryggraden derivatiserade med flera NIR fluorokromer (VM110/Prosense750, ex / em 750/780nm, VisEn Medical, Woburn, MA) som resulterar i starka intramolekylära dämpning vid baslinjen. 10 Efter riktade enzymatisk klyvning av cysteinproteaser såsom cathepsin B (känd colocalize med plack makrofager), den fluorokromer separata, vilket resulterar i betydande förstärkning av NIRF signalen. Intravaskulär upptäckt av NIR fluorescens signal genom utnyttjad romanen 2D intravaskulär NIRF kateter gör nu med hög upplösning, geometriskt noggranna in vivo detektion av cathepsin B-aktivitet i inflammerade plack.

In vivo molecular imaging av ateroskleros med hjälp av kateter-baserad 2D NIRF bildhantering, i motsats till en tidigare 1-D spektroskopiska metoden, är sex ett nytt och lovande instrument som använder utökade proteas aktivitet i makrofager-rika plack att upptäcka vaskulär inflammation. 11,12 Följande forskning protokoll som beskriver användningen av en intravaskulära 2-dimensionella NIRF kateter till bild och karaktärisera plack struktur utnyttja viktiga aspekter av plack biologi. Det är en översättningsbara plattform som när de integreras med befintliga kliniska imaging-teknik, inklusive angiografi och intravaskulärt ultraljud (IVUS) erbjuder en unik och ny integrerad multimodal molecular imaging teknik som skiljer inflammatoriska atheromata och möjliggör detektion av intravaskulära NIRF signaler i mänsklig storlek kranskärl .

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In vivo djurmodell: Generation of Experimental AortoIliac Åderförkalkning

1) Baseline Angiografi och Ballong Denudation

  1. Före få bas angiografi och ballong denudation, är en New Zealand vit kanin matas ett högt kolesterol (1%) diet för en vecka. Detta djur utnyttjas för translationell relevans som 1) det aorto-iliacs fartyg i kaniner är samma kaliber som mänskliga hjärtats kranskärl (2,5-3.5mm) och 2) hyperlipidemic, ballong-skada modellen ger inflammerade åderförkalkning med liknande inflammatoriska celler (makrofager ) och molekyler (cathepsins) som i människans ateroskleros.
  2. Efter kolesterol utfodring, är djuret bedövas med propofol och ketamin. En en-tums ventrala mittlinjen halsen snitt görs med hjälp av en storlek 15-skalpell blad. Använda dissektion tekniker är musklerna under fascian på höger sida av luftstrupen exponeras. Den vänstra sternocephalicus muskeln är avskilt längs bindväv korsningen, och rätten gemensamma halspulsådern är utsatt för. Artären är separerad från vagusnerven. Proximal och distal sutur slingor placeras på artären för att möjliggöra indragning och ocklusion. A 1 till 2 mm fasade arteriotomy görs genom vilket en 5 Franska (ytterdiameter 1.67mm) vaskulära Manteln är insatt och heparin (1000μ/mL, ~ 150units/kg) administreras intra-arteriellt via slidan.
  3. Kontrast färg (Ultravist) är sedan injiceras (1 till 2 ml) under en 2 andra perioden för att få en kontroll angiogram av distala aorta och båda artärer iliaca.
  4. Den iliofemoral artärer och kroppspulsådern då skadas av endothelial denudation. Använda standard fluoroskopi metoder är en 3Fr Fogarty embolektomi kateter placeras i distala iliofemoral artären och uppblåst med 0,3 till 0,5 cc kontrast (50% contrast/50% koksaltlösning) eller luft. Katetern är då tillbaka proximalt i sin uppblåsta tillstånd avstånd längs den högra iliaca och distala aorta upp till starten av den vänstra njurartären. Efter ballongen denudation är angiografi upprepas att dokumentera fartyget patency. Efter angiografi, alla katetrar och hylsor bort och den proximala rättighet som är gemensam halspulsådern är knyts ihop, är muskler och fascia sys med en 4 / 0 absorberbara suturer, och huden snitt avslutades med en 4 / 0 icke absorberbara suturer.
  5. Djuret får sedan återhämta sig med administrering av en dos antibiotika (Cephazolin, 0,5 gram IM). Smärtstillande medel inklusive 0,01 mg / kg buprenorfin IM (två gånger om dagen om det behövs). Djur är sedan fortsatt på 1% kolesterol i 4 veckor efter ballong denudation. Vid vecka 5, är djur över till 0,3% kolesterol diet.

Integrerad Multimodal Imaging om Rabbit Atheromata

2) Märkning av proteolytically aktivt inflammerade plack med injicerbart Nanosensorn, angiografi, intravaskulärt ultraljud (IVUS) och in vivo intravaskulär NIRF avbildning av Rabbit aterom

  1. Åtta veckor efter ballong skada och 24 timmar före avbildning, är kaninen injiceras med intravenösa 500 nmol / kg Prosense/VM110 (PerkinElmer) via örat ven.
  2. Tjugofyra timmar efter injektionen, djur bedövas och arteriell tillgång erhålls via vänster gemensamma halspulsådern (se steg 1.2). Intraarteriell heparin administreras (150 enheter / kg). Baseline angiografi erhålls enligt ovan.
  3. En IVUS kateter lastas en klinisk kranskärl kan 0,014 tum tråd och sätts in i slidan. Använda röntgengenomlysning är den röntgentäta spetsen av kabeln placeras distalt i rätt bäckenartären. Den IVUS Katetern är därefter avancerat till proximala bäckenartären med en vanlig klinisk monorail teknik.
  4. En 100 mm tillbakadragande inleds och bilderna spelas in. Längsgående rekonstruktion av fartyget uppnås och luminala plack identifieras.
  5. Den NIRF kateter 11,12 lastas på 0,014 tum tråd (monorail system), och katetern försiktigt in i slidan och bildbehandling huvudet är placerad distalt i höger bäckenartären.
  6. Flera automatiserade pullbacks (1 mm / sek längsgående tillbakadragande, 30 varv per minut) utförs och fluorescens signaler inom en zon av åderförkalkning noteras. Bilderna registreras och vidare behandling med lämplig skalning och fönstersystem beroende på räckvidd av signal uppnås.

3) dödshjälp och isolering av ex vivo aorto-iliaca vävnad

  1. Eutanasi sker med 1 ml av dödshjälp agent (lösning av 390mg natrium pentobarbital och 50mg fenytoinnatrium), intravenöst, injektion.
  2. Den arteriella Trädet är perfusion med 0,9% koksaltlösning tills sämre hålvenen är fritt från blod. Åderförkalkningen aorta och bäckenartärerna identifieras och dissekeras fri från omgivande vävnader. Dessutom, liten 2 x 2 cm bitar av liver, njure, mjälte och hjärta är också erhållas.
  3. Ex vivo NIRF avbildning med det intravaskulära NIRF avbildning katetern kan göras på detta stadium. Fartyget är långsträckt och NIRF katetern åter in i proximala aorta tills avbildning huvudet är placerat på rätt bäckenartären eller bifurkation. Flera automatiserade pullbacks utförs som ovan (se 2.6).

4) Ex vivo Fluorescens Reflektans Imaging (FRI) av de dissekerade aorta och artärer iliaca

  1. Dissekerade vävnad placeras i 10-20 cc fysiologisk koksaltlösning och transporteras för Fre analyser (Kodak Image Station 4000mm Pro, Carestream Health, Inc.).
  2. Aorta, iliaca fartyg är avlånga till ungefärliga realtid längder och bilder erhålls vid flera våglängder [vitt ljus, grönt fluorescerande kanal (ex 495 nm, EM 515 nm), Cy5 (ex 565 nm, EM 670 nm) och Cy7 (ex 650 nm, EM 760 nm)] kanaler. En serie exponeringstider används för varje våglängd (0,1-30sec) och förvärvade bilder exporteras som DICOM eller 16-bitars skalförändrad TIFF-filer för vidare analyser. Som positiva och negativa kontroller, är organ (lever, mjälte, njure och hjärta) avbildade på liknande kanaler och tider exponering.
  3. Områden med ökad signal i det nära infraröda kanal (780nm +) noteras i åderförkalkade artärer.

5) Tissue Bädda för sektionering och immunhistokemisk analys

  1. Områden av normal (icke-skadad vävnad, dvs vänster bäckenartären) och områden med plack är identifierade och små 5-10 mm ringar av vävnad är inbäddade i oktober (Optimal Kapning Temperatur) media. Blockerar förvaras vid -80 C tills snittning.
  2. Standardmetoder för sektionering och immunhistokemiska analyser utförs. Hematoxylin och eosin bets, Ram-11 och cathepsin B färgning utförs.

Analyser och integration av multimodala bilder (angiografi, IVUS, NIRF och fre)

6) Bearbetning av NIRF och fre bilder

  1. DICOM-filer som innehåller bilddata från NIRF och fre (tas på nära infraröd 780 nm-kanal) är pullbacks behandlas med hjälp av MATLAB och Osirix programvara, respektive. Korrekt fönstersystem för att visa hela skalan av signalstyrka uppnås. Slutlig bilder exporteras som TIFF-filer.
  2. Filer importeras till standarden för bildbehandling (Keynote kan användas). Bilderna är i linje baseras på referenspunkter (dvs kotorna på angiogrammet iliaca bifurkation och njurartärstenos). Områden av normala kärl och plack identifieras.
  3. Regioner av intresse (ROI) är manuellt spåras (för normal vävnad och områden av plack) och betyder signalen intensiteter förvärvas med hjälp av Osirix och MATLAB, respektive för både fre och NIRF bilder. Att styra lämpligt spåra, är de längsgående IVUS bilden av fartyg som används och identifiering av normala kärl och plack är lätta att identifiera.
  4. Mål-to bakgrund (TBR) nyckeltal är beräknade för plack zoner.

Representativa resultat:

Efter avslutad ovannämnda protokoll, kan vi finna och karakterisera områden med utökad cathepsin proteas aktivitet i inflammatoriska plack i aorta och fartyg iliaca. Injektion av en som aktiveras Nanosensorn (Prosense/VM110) ger oss möjlighet att identifiera proteolytically aktiva plack. Dessa visas som ljusa eller signal intensiv områden där avbildas med Fre i nära infraröd kanal (750 nm). Den NIRF pullbacks korrelerar med ökad signalstyrka med fre och anpassningar med IVUS som tillåter anatomiska registrering av NIRF signaler. Beräknat plack TBR är från fre och NIRF var liknande (se figur 3: genomsnittlig NIRF TBR 4,2, menar fre TBR 2,9). Immunhistokemiska analyser av ljusa plack bekräftar intensiv närvaro RAM-11 och cathepsin B-verksamhet i områden med plack (data visas inte).

Figur 1
Figur 1. Schematisk av 2D NIRF kateter för att förlänga den kliniska potentialen i en 1D NIRF avkänning metod 6, konstruerade vi en ny 2-D NIRF-kateter för intravaskulär bildbehandling. 11,12 Den specialbyggda kateter består av en optisk fiber (125 mikron diameter inrymt i polyeten slang: 2.9F) som lyser med hjälp av en 750 nm källa laser excitation. Laserljus sänds ut i 90 graders vinkel i förhållande till fiber axeln. Systemet använder två automatiserade motorer (roterande och translationell) för att möjliggöra samtidig 360 graders bilder och longitudinella tillbakadragande att få sanna 2D-avbildning. Bilder används med tillstånd från referens 11.

Figur 2
Figur 2. Schematiskt visar proteas-medierad aktivering av Nanosensorn, Prosense/VM110. Bild används med tillstånd från referens 10.

Tabell 1 Figur 3. In vivo och ex vivo TBRs plack (mål-till bakgrunden nyckeltal)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Inflammerade högrisk-eller sårbara plack är sannolikt svarar för merparten av hjärtinfarkt. Identifieringen av sådana tavlor innan symtomen har viktiga kliniska implikationer både att förutsäga resultat och vägledande medicinsk behandling. Konventionella koronar arteriell avbildningsmetoder, såsom röntgen-angiografi fokus oftast på karaktärisering av luminala narrowings snarare än att belysa underliggande biologiska profiler för hög risk, vanligen icke-stenotiska lesioner. Intravaskulär NIRF molecular imaging erbjuder en hjärtkateterisering laboratorium översättningsbara strategi som innefattar biologi plack inflammation genom att utnyttja nanosensorer att identifiera aktiva makrofager i plack, en cellulär kännetecken för en inflammerad plack benägenhet att brista. 9

Följande protokoll som beskrivs ovan använder ett multimodalt integrerad strategi som kombinerar angiografi, IVUS och NIRF bildbehandling för att identifiera inflammerade plack. Denna nya 2D NIRF kateter kapitaliserar på ett positivt optiska egenskaper det nära infraröda fluorescens bandbredd för att upptäcka molekylära signaturer genom blod, och är en lovande in vivo metod för molekylär bildanalys. Den Nanosensorn Prosense/VM110 är kopplad till fluorokromer som släpper fluroescence vid 780 nm och använder automatiskt släcka i avsaknad av proteolytiska klyvningen eller aktivering av enzymet cathepsin B (mycket uttryckt i inhemska makrofager). Upptäckt av in vivo fluorescenssignalen av NIRF katetern medger identifiering av makrofager-lastad plack (TBR 2,9). Användningen av ex vivo fluorescens reflektans imaging (fre) bekräftar förekomst av NIR fluorescenssignalen inom områden av plack (TBR 4,2). Immunhistokemisk färgning av RAM-11 och cathepsin inom områden med plack bekräftar den intensiva infiltration av cathepsin-B-positiva makrofager (data visas inte).

Införlivandet av IVUS och NIRF signalen kan smält att kartlägga signalintensiteten inom synligt plack längs fartygets längd (data visas ej) och erbjuder en unik möjlighet att ytterligare klarlägga luminala plack morfologi och makrofag innehåll. Aktuella begränsningar av ovan nämnda tekniken inkluderar oförmåga att exakt samtidigt registrera IVUS och NIRF pullbacks. Samtidig tillbakadragande via ett integrerat nät för dubbla modal kateter skulle öka noggrannheten i signalen plats och eventuellt möjliggöra lösning av placering av signal i kärlväggen (dvs. djup signal inom lumen, media eller adventitia). Dubbla modal NIRF / IVUS eller NIRF / optisk koherens tomografi (OCT) katetrar fusion förväntas därför att få ytterligare avbildning av signal och införliva plack arkitektur med biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

FAJ - Tidigare konsult, VisEn Medical, arvoden, Boston Scientific

Acknowledgments

Stöd för detta arbete lämnades av National Institutes of Health bidrag # R01 HL 108.229, American Heart Association Scientist utveckling Grant # 0830352N, Howard Hughes Medical Institute Career Development Award Broadview Ventures, Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013 enligt bidragsavtal Avtalet # 235.689) och MGH William Schreyer Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Prosense 750 Visen Medical VM110 500 nmol/kg IV injection
Heparin Sodium APP Pharmaceuticals 401586D
Cephazolin NovaPlus 46015683
Lidocaine HCL 2% Hospira Inc. NDC 0409-4277-01
Buprenorphine Bedford Laboratories NDC 55390-100-10
Ketamine Hospira Inc. NDC 0409-2051-05
High Cholesterol Diet 1% Research Diets C30293
HIgh Cholesterol Diet 0.3% Research Diets C30255

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andersson, J., Libby, P. Adaptive immunity and atherosclerosis. Clin Immunol. 134, 33-46 (2010).
  2. Calfon, M. A., Vinegoni, C. Intravascular near-infrared fluorescence molecular imaging of atherosclerosis: toward coronary arterial visualization of biologically high-risk plaques. Journal of Biomedical Optics. 15, 011107-011107 (2010).
  3. Chen, J., Tung, C. -H. In Vivo Imaging of Proteolytic Activity in Atherosclerosis. Circulation. 105, 2766-2771 (2002).
  4. Jaffer, F. A., Libby, P. Molecular Imaging of Cardiovascular Disease. Circulation. 116, 1052-1061 (2007).
  5. Jaffer, F. A., Libby, P. Optical and Multimodality Molecular Imaging: Insights Into Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29, 1017-1024 (2009).
  6. Jaffer, F. A., Vinegoni, C. Real-Time Catheter Molecular Sensing of Inflammation in Proteolytically Active Atherosclerosis. Circulation. 118, 1802-1809 (2008).
  7. Kim, D. -E., Kim, J. -Y. Protease Imaging of Human Atheromata Captures Molecular Information of Atherosclerosis, Complementing Anatomic Imaging. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30, 449-456 (2010).
  8. Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420, 868-874 (2002).
  9. Naghavi, M., Libby, P. From Vulnerable Plaque to Vulnerable Patient: A Call for New Definitions and Risk Assessment Strategies: Part I. Circulation. 108, 1664-1672 (2003).
  10. Weissleder, R., Tung, C. -H. In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotech. 17, 375-375 (1999).
  11. Razansky, R. N., Rosenthal, A. Near-infrared fluorescence catheter system for two-dimensional intravascular imaging in vivo. Optics Express. 18, 11372-11381 (2010).
  12. Jaffer, F. A., Calfon, M. A. Two-Dimensional Intravascular Near-Infrared Fluorescence Molecular Imaging of Inflammation in Atherosclerosis and Stent-Induced Vascular Injury. Journal of the American College of Cardiology. 57, 2516-2526 (2011).
<em>In vivo</em> Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravaskulär Molecular Imaging av inflammatoriska plack, en multimodal metod för avbildning av åderförkalkning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Calfon, M. A., Rosenthal, A., Mallas, G., Mauskapf, A., Nudelman, R. N., Ntziachristos, V., Jaffer, F. A. In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis. J. Vis. Exp. (54), e2257, doi:10.3791/2257 (2011).More

Calfon, M. A., Rosenthal, A., Mallas, G., Mauskapf, A., Nudelman, R. N., Ntziachristos, V., Jaffer, F. A. In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis. J. Vis. Exp. (54), e2257, doi:10.3791/2257 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter