Summary
CFSE קוולנטית תוויות חיים ארוכים מולקולות תאיים עם צבע פלואורסצנטי, carboxyfluorescein. ככזה, כאשר תא CFSE שכותרתו מתחלק, הצאצאים שלה יש מחצית מכמות הקרינה, אשר יכול לשמש ובכך להעריך את חלוקת התא. מאמר זה מתאר את ההליכים משמש בדרך כלל עבור תיוג לימפוציטים עכבר עם CFSE.
Abstract
Carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE) הוא אמצעי יעיל ופופולרי לפקח על חלוקת 1-3 לימפוציטים. CFSE קוולנטית תוויות חיים ארוכים מולקולות תאיים עם צבע פלואורסצנטי, carboxyfluorescein. לכן, כאשר תא CFSE שכותרתו מתחלק, הצאצאים שלו ניחן במספר מחצית carboxyfluorescein-tagged מולקולות ולכן כל חלוקת התא ניתן להעריך על ידי מדידת הירידה המקבילה הקרינה התא באמצעות cytometry הזרימה. הקיבולת של CFSE לתייג אוכלוסיות לימפוציטים בעוצמה גבוהה פלורסנט השונות נמוכה במיוחד, בשילוב עם רעילות לתא הנמוכה, להפוך אותו צבע אידיאלי למדוד חלוקת התא. מאז היא לצבוע והעמסת מבוססי זה גם תואם עם מגוון רחב של fluorochromes אחרים מה שהופך אותו החלים cytometry רב צבע זרימה. מאמר זה מתאר את ההליכים משמש בדרך כלל עבור תיוג לימפוציטים בעכבר לצורך ניטור עד 8 חלוקות תא. תאים אלה שכותרתו יכול לשמש הן במבחנה במחקרים vivo.
Protocol
1) מגיב ההתקנה
1.1) מניות CFSE פתרון
לצבוע CFSE נרכש כמו carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFDA, SE) (MW 557.47 g / חפרפרת), בדרך כלל 25 מ"ג צלוחיות. ממיסים את 25 מ"ג ב 8.96 מ"ל DMSO לפתרון הסופי המניות של 5 מ"מ (50-100 לאחסן aliquots μL ב -20 ° C במשך כמה חודשים). CFDA, SE יגיב עם בתמיסה מימית כך קריטי, כי חשיפה כזו להימנע במהלך האחסון.
1.2) לימפוציטים
בידוד לימפוציטים מן הטחול או בלוטות הלימפה מעכברים resuspend ב 1 מ"ל של מדיום תרבות (למשל RPMI) עם 5% חום מומת (HI) עוברית עגל בסרום (FCS), עם ריכוז תאים של בין 0.5 x אוקטובר 06-10 10 x 7 / mL.
2) CFSE תיוג
2.1) שגרתיות השיטה:
- ביסודיות resuspend תאים בנפח 1 מ"ל של מדיום ומקום בקפידה התחתון של צינור (לא הרטובות) טריים חרוטי 10 מ"ל.
- הנח את הצינור אופקית (באמצעות צינור אי - הרטובות תמנע 1 מ"ל תאים ההשעיה מן מרגש בטרם עת ערבוב עם פתרונות CFDA SE).
- בזהירות להוסיף 110 μL של PBS לחלק בלתי הרטובות של הפלסטיק בחלקו העליון של הצינור כדי להבטיח שזה לא ליצור קשר עם פתרון התא.
- Resuspend 1.1 μL של המניה 5 מ"מ של CFDA, SE ב 110 PBS μL.
- כובע במהירות את הצינור ואת המערבולת להפוך גם לקבל אחיד ומהיר ערבוב של פתרונות. שים לב כי צבע CFSE הוא בריכוז הסופי של 5 מיקרומטר, לעומת זאת, הריכוז האופטימלי ייתכן שייקבע עבור כל אצווה מוכנים, ובדקה אז כל 6 חודשים על מנת להבטיח שהוא יעיל.
- דגירה תאים 5 דקות בטמפרטורת החדר. שים לב כי בעת המרה של CFDA, SE כדי CFSE (ראה דיון) צבען הופך הניאון נוטה ובכך הלבנה על ידי חשיפה לאור מוגזם. לפיכך, מומלץ להגן על הצינור מן האור מנקודה זו ואילך, למשל על ידי כיסוי אותו עם רדיד אלומיניום.
- שטפו תאים על ידי דילול של 10 כרכים של 20 ° C PBS המכיל 5% HI FCS, sedimenting ידי צנטריפוגה XG ב 300 דקות ב 5 20 ° C ולהשאיר את supernatant. חזור על לשטוף פעמיים נוספות.
2.2) שיטה אלטרנטיבית, אשר מתאים גם מספרים התא גבוה יותר (10-30 x 10 7):
- הכן 2 x (10 מיקרומטר) CFDA, פתרון SE על ידי הוספת 2 μL של המניה 5 מ"מ עד 1 מ"ל של PBS ובמהירות להוסיף זה 1 מ"ל של תאים resuspended ביסודיות, אז מהר מכסה את הצינור ואת המערבולת להפוך גם לקבל אחיד מהיר ערבוב.
- דגירה התאים 5 דקות בטמפרטורת החדר לשטוף כמו בשלבים 2.1 (ו) ו 2.1 (ז).
2.3) תאים אז יכול להיות מיושם על פרוטוקול הריבית לזירוז של חלוקת התא. תאים תווית ניתן להשתמש גם במבחנה מבחני vivo.
2.4) בסיום של assay שגשוג התאים נקצרים ונותחו על ידי cytometry הזרימה (ראו להלן דוגמאות מייצגות).
3) נציג תוצאות
כדי להעריך את התפשטות לימפוציטים על ידי דילול CFSE, כדאי לדעת את הקרינה של תאים המאוחדת (כלומר מרבית הקרינה) ולא שכותרתו תאים (כלומר הקרינה מינימום). לכן, תכנון הניסוי שלך צריך לקחת פקדים אלה בחשבון. להלן דוגמאות של במבחנה מבחני vivo באמצעות CFSE למדוד CD8 + T חלוקת התא על ידי cytometry הזרימה.
3.1) בשנת גירוי חוץ גופית
איור 1 מציג את הפרופילים של CFSE CFSE שכותרתו ovalbumin (OVA) ספציפיים לקולטן תא T CD8 + מהונדס OT-T אני תאים לאחר 3 ימים עם התרבות תאים דנדריטים פעמו עם כמויות שונות של OVA. CD8 + T תאים מטוהרים מן בלוטות הלימפה והטחול של OT-אני עכברים תויגו עם CFSE ו 1 x 10 5 תאים בתרבית עם 3.3 DC x 4 10. DC פעמו בו עם OVA עבור שעה 1 ב 37 ° C ורחץ לפני פעמיים לתרבות. לאחר 3 ימים, התאים בהם קוצרים ומסומן עם אנטי CD8-APC נוגדנים Hoechst 33258 ולאחר מכן נותחו על ידי cytometry זרימה (50,000 אירועים שנאספו). חיים (Hoechst 33,258 -) CD8 + תאים מוצגים. כמו שולטת, CD8 + T תאים בתרבית לבד, מראה את עוצמת CFSE של אי מחולק לתאים, בעוד התאים הלא שכותרתו מציגה את פלואורסצנציה אוטומטי של התאים ואת גבולות של חלוקות תא לזיהוי. שים לב 4 פסגות CFSE ניתן לראות בכל אחד הפאנלים בדוגמה זו, המציין כי התאים שעברו עד 3 אוגדות.
3.2) בשנת גירוי vivo
איור 2 מראה את הפרופילים של CFSE CFSE שכותרתו קולטן T-OVA ספציפי תא מהונדס CD8 + OT-T לתאים אני אחרי 3 ימים in vivo in נוכחות של OVA 20 מיקרוגרם. CD8 + T תאים מטוהרים מן בלוטות הלימפה והטחול של CD45.1 congenic OT-אני עכברים תויגו עם CFSE ו 5 x 10 6 תאים iv מוזרק לווריד הזנב לרוחב של C56BL/6J (CD45.2 +) בעכברים. לאחר 2 שעות הוזרקו לעכברים iv עם 20 מיקרוגרם של OVA. לאחר 3 ימים, spleens מעכברים נאספו, הפך ההשעיה תא בודד, שכותרתו עם אנטי B220-PerCP, אנטי CD8-APC-Cy7 ואנטי CD45.1-PE-Cy7 נוגדנים Hoechst 33258 ונותחו לאחר מכן על ידי cytometry זרימה (1,000,000 אירועים שנאספו). חיים (Hoechst 33,258 -) B220-תאים מוצגים בלוח השמאלי מגודרת CD8 + + CD45.1 התאים הראו בלוח הנכון. כמו שולטת, unstimulated CFSE שכותרתו CD8 + T תאים, מראה את עוצמת CFSE של אי מחולק לתאים, בעוד שאינו מסומן תאים מציגה את פלואורסצנציה אוטומטי של התאים ואת גבולות של חלוקות תא לזיהוי. שים לב כי השימוש הבדל CD45 allotypic חיוני בפתרון CD8 + T תאים שהועברו מהמחשב המארח, כפי שהם תת קטין מכלל התאים CD8 + T (הפאנל השמאלי). שים לב, רוב התאים ליפול בתוך 7 הפסגות CFSE בדוגמה זו (פאנל מימין), המציין כי התאים שעברו עד 6 חטיבות.
באיור 1. היכולת של CFSE שכותרתו ovalbumin (OVA) ספציפיים קולטן T תא מהונדס CD8 + OT-I לתאי T להיענות במבחנה כדי DC פעמו עם ריכוזים שונים של OVA, הנתונים המוצגים להיות אחרי תרבות ימים 3. הערה האוכלוסייה הלא מחולק של CD8 + T תאים בהעדר אנטיגן (אור היסטוגרמה אפור) ו פלואורסצנציה אוטומטי של האוכלוסייה הלא מסומן (היסטוגרמה אפור כהה). איור מתאר CD8 + תאי T יש לחלק 1-3 פעמים על בסיס דילול CFSE פסגות, עם יותר תאים T חלוקת על ריכוזי אנטיגן גבוה יותר.
איור 2. היכולת של CFSE שכותרתו ovalbumin (OVA) ספציפיים קולטן T תא מהונדס CD8 + OT-I לתאי T, כאשר הועבר adoptively לעכברים C57BL / 6 כדי להגיב OVA, הנתונים המוצגים 3 ימים לאחר העברת המאמצת פאנל שמאל:. CD8 +, CD45. 1 + 1 תאים OT-T בעכברים הנמען. פאנל ימין: התפשטות פרופיל CFSE. הערה האוכלוסייה הלא מחולק של CD8 + T תאים בעכברים הנמען לא מקבל אנטיגן (אור היסטוגרמה אפור) ו פלואורסצנציה אוטומטי של אי שכותרתו לימפוציטים (היסטוגרמה אפור כהה). איור מתאר CD8 + תאי T יש לחלק 1-6 פעמים על בסיס דילול CFSE פסגות.
איור 3. ייצוג של אירועים מולקולריים שונים המתרחשים במהלך תיוג של תאים עם carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFDA, SE). לפרטים של התהליך לראות טקסט דיון. הערה: "CFSE" ראשי תיבות הגנרית, לא CFDA, SE, המשמש לתיאור מגיב תיוג תיוג את ההליך באופן כללי. איור המבוסס על פאריש 4.
Discussion
על מנת להעריך את האופן CFSE עובד ולמה תיוג אחיד מהיר נדרש השימוש בניתוח תפוצת, כדאי להבין את הבסיס המולקולרי של תיוג תא CFSE. זה יכול להיות מחולק לשני שלבים, 1) ערך תא 2) תיוג חלבון (איור 3). 1) כניסה Cell: כניסה של צבע בתוך התא מתווך על ידי הטופס diacetylated של צבע, carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFDA, SE). Acetates להפוך את permeant צבע קרום מאוד המאפשר זרימה מהירה על פני קרום התא. Esterases, להציג בתוך התא, לדבוק acetates מ CFDA, SE ובכך להצמיח את הטופס CFSE של צבע אשר permeant קרום הרבה פחות, ובכך לרכז את צבען בתוך התא. 2) תיוג חלבון: בעוד הן CFDA, SE ו CFSE יש אמינו-reactive שרשראות צד succinimidyl, רק CFSE הוא פלורסנט. ריכוז גבוה של תאיים CFSE מאפשרת תיוג רמת מהיר גבוה של חלבונים תאיים. תיוג CFSE של תאים חייב להתבצע במהירות על מנת לקבל אוכלוסייה שכותרתו homogenously של תאים, שהוא קריטי לפתרון תאים שעברו מספר חטיבות כפי שמוצג בתוצאות נציג (איור 1 ו - 2).
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
העבודה דיווחו במאמר זה נתמך על ידי בריאות לאומי המועצה למחקר רפואי (NHMRC) של אוסטרליה תוכנית גרנט (CRP) ואת פרויקט NHMRC גרנט (CRP לבין BJCQ). כמו כן BJCQ הוא פיטר דוהרטי NHMRC עמית דוקטורים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CFDA,SE | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| DMSO | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lymphocytes | eg mouse or human | ||
| RPMI | GIBCO, by Life Technologies | ||
| FCS | SAFC Global | ||
| 10-15ml conical tubes | Falcon BD | ||
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Aluminium foil | Capral Aluminium | ||
| Vortex | Scientific Industries Inc. | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer | BD Biosciences |
References
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171, 131-137 (1994).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. , (2009).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2, 2049-2056 (2007).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
