Summary
CFSE التسميات تساهميا المعمرة الجزيئات داخل الخلايا مع صبغة الفلورسنت ، carboxyfluorescein. على هذا النحو ، وعندما خلية CFSE المسمى القسمة ، وعلى آله ونصف كمية مضان ، والتي يمكن بالتالي استخدامها لتقييم انقسام الخلايا. توضح هذه المقالة الإجراءات التي تستخدم عادة لوضع العلامات اللمفاويات الفأر مع CFSE.
Abstract
Carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) هو وسيلة فعالة لرصد والشعبية لمفاوية 1-3 الانقسام. CFSE التسميات تساهميا المعمرة الجزيئات داخل الخلايا مع صبغة الفلورسنت ، carboxyfluorescein. وهكذا ، عندما خلية CFSE المسمى القسمة ، وهبوا ذرية مع نصف عدد carboxyfluorescein الموسومة الجزيئات ، وبالتالي يمكن تقييم كل انقسام الخلايا عن طريق قياس انخفاض مماثل في مضان الخليوي عبر التدفق الخلوي. قدرة CFSE لتسمية السكان اللمفاويات مع كثافة عالية من التباين الفلورية منخفضة بشكل استثنائي ، إلى جانب خلية سميتها منخفضة ، تجعل من صبغة مثالية لقياس انقسام الخلايا. نظرا لأنه هو صبغ فلوريسئين المستندة كما أنه متوافق مع مجموعة واسعة من fluorochromes الأخرى مما يجعلها تنطبق على التدفق الخلوي متعددة الألوان. توضح هذه المقالة الإجراءات التي تستخدم عادة لوضع العلامات اللمفاويات الماوس لغرض رصد ما يصل إلى 8 الانقسامات الخلوية. ويمكن استخدام هذه الخلايا المسمى على حد سواء لفي التجارب المختبرية والدراسات المجراة.
Protocol
1) إعداد الكاشف
الأسهم CFSE 1.1) الحل
ويتم شراء الصبغة CFSE كما ثنائي الأسيتات carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFDA ، SE) (MW 557.47 غ / مول) ، وعادة في قوارير 25 ملغ. حل ملغ في 25 مل 8،96 DMSO للتوصل إلى حل نهائي الأسهم من 5 ملم (5-10 المخزن كما aliquots ميكرولتر في -20 درجة مئوية لعدة أشهر). سوف CFDA ، SE تتفاعل مع محلول مائي ولذلك فمن الأهمية بمكان أن يتم تجنب التعرض لمثل هذه أثناء التخزين.
1.2) الخلايا اللمفاوية
عزل الخلايا الليمفاوية من الطحال والغدد الليمفاوية أو من الفئران وresuspend في 1 مل من مستنبت (مثل RPMI) مع 5 ٪ للحرارة المعطل (مرحبا) الجنين مصل العجل (FCS) ، مع تركيز خلية من بين 0.5 × 10 6 -- 10 × 10 / 7 مل.
2) وضع العلامات CFSE
2.1 الطريقة الروتينية) :
- resuspend الخلايا بدقة في حجم 1 مل من المتوسط والمكان بعناية في الجزء السفلي من أنبوب الطازجة (غير المبللة) مخروطية 10 مل.
- وضع أنبوب أفقيا (باستخدام أنبوب غير المبللة سيمنع 1 مل خلية تعليق من التحرك قبل الأوان والاختلاط مع حلول CFDA SE ،).
- إضافة بعناية ميكرولتر من 110 برنامج تلفزيوني إلى الجزء غير المبللة من البلاستيك في الجزء العلوي من الأنبوب الحرص على ان لا يجعل الاتصال مع الحل الخلية.
- Resuspend 1.1 ميكرولتر من المخزون 5 مم من CFDA ، SE في برنامج تلفزيوني 110 ميكرولتر.
- غطاء الأنبوب ، وسرعان ما قلب الدوامة ، وكذلك للحصول على خلط موحد سريع للحلول. لاحظ أن الصبغة CFSE هو في التركيز النهائي من 5 ميكرون ، ومع ذلك ، قد تركيز الأمثل يجب أن تكون مصممة لاستعداد كل دفعة ، ودققت ثم كل 6 أشهر للتأكد من أنه غير فعال.
- احتضان خلايا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لاحظ أنه عند التحويل من CFDA ، SE إلى CFSE (انظر المناقشة) صبغة الفلورسنت ويصبح عرضة للتبيض وبالتالي التعرض للضوء المفرطة. وبالتالي ، فإنه من المستحسن لحماية أنبوب من الضوء من هذه النقطة ، على سبيل المثال عن طريق تغطية ذلك مع احباط الالومنيوم.
- غسل الخلايا تمييع في 10 مجلدا من 20 درجة مئوية PBS تحتوي على 5 ٪ FCS مرحبا ، المترسبة بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية ، ونبذ طاف. تكرار غسل كميات أكبر من مرتين.
2.2 الأسلوب البديل) ، الذي هو أيضا مناسبة للأرقام أعلى الخلية (10 -- 30 × 10 7) :
- إعداد 2 × (10 ميكرومتر) CFDA حل SE ، وذلك بإضافة 2 ميكروليتر من المخزون ملي 5-1 مل من برنامج تلفزيوني وبسرعة إضافة إلى هذه الخلايا 1 مل من معلق جيدا ، ثم سرعان ما غطاء الأنبوب وقلب الدوامة ، وكذلك للحصول على سريع موحدة الخلط.
- احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وغسل كما في الخطوات 2.1 (و) و 2.1 (ز).
ويمكن عندئذ 2.3) خلايا يمكن تطبيقها على بروتوكول لمصلحة لتحريض انقسام الخلايا. ويمكن استخدام الخلايا المسمى في كل من في المختبر والمجراة في المقايسات.
2.4) عند الانتهاء من الفحص الانتشار ، ويتم حصاد الخلايا وتحليلها من قبل التدفق الخلوي (أنظر أدناه للاطلاع على نماذج تمثيلية).
نتائج الممثل 3)
لتقييم انتشار الخلايا اللمفاوية التي CFSE التخفيف ، فإنه من المفيد أن نعرف مضان من الخلايا غير مقسمة (أي الحد الأقصى مضان) وغير المسماة خلايا (أي مضان الحد الأدنى). لذا ، ينبغي أن التصميم الخاص بك تجريبية تأخذ هذه الضوابط في الاعتبار. فيما يلي أمثلة من في المختبر والمجراة في المقايسات CFSE به لقياس CD8 + T انقسام الخلية التي التدفق الخلوي.
3.1) في المختبر التحفيز
الشكل 1 يوضح ملامح CFSE من CFSE المسمى ovalbumin (OVA) محددة وراثيا مستقبلات الخلية تي CD8 + T OT - I الثقافة الخلايا بعد 3 أيام مع الخلايا الجذعية نابض مع كميات مختلفة من OVA. CD8 + وصفت الخلايا التائية تنقيته من العقد اللمفاوية والطحال من OT - I مع الفئران وCFSE 1 × 10 5 الخلايا المستزرعة مع 3.3 X 4 10 DC. العاصمة حيث نابض مع OVA : 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، وقبل غسلها مرتين في الثقافة. بعد 3 أيام ، حيث تحصد الخلايا وصفت المضادة للCD8 - APC الأضداد وهويشت 33258 ومن ثم تحليلها من قبل التدفق الخلوي (50،000 الأحداث التي تم جمعها). يعيش (هويشت 33258 --) ترد CD8 + الخلايا. والضوابط ، CD8 + الخلايا التائية المثقف وحده ، ويبين شدة CFSE من الخلايا غير المنقسمة ، في حين أن خلايا غير المسمى يبين لصناعة السيارات في مضان من الخلايا وحدود كشف الانقسامات الخلوية. علما أنه يمكن رؤية قمم CFSE 4 في كل من لوحات في هذا المثال ، تشير إلى أن الخلايا قد خضعت تصل إلى 3 أقسام.
3.2) في تحفيز الجسم الحي
الشكل 2 يوضح ملامح CFSE من CFSE المسمى OVA محددة مستقبلات الخلايا التائية CD8 + المعدلة وراثيا OT - I T الخلايا بعد 3 أيام في الجسم الحي طن وجود OVA 20 ميكروغرام. CD8 + وصفت الخلايا التائية تنقيته من العقد الليمفاوية والطحال من الفئران CD45.1 OT - I مسانج مع CFSE و 5 × 10 6 خلايا حقن في الوريد الرابع الذيل الوحشي C56BL/6J (CD45.2 +) الفئران. بعد ساعة 2 الفئران تم حقن الرابع مع 20 ميكروغرام من OVA. بعد 3 أيام ، وجمعت الطحال من الفئران ، وتقدم الى تعليق خلية واحدة ، وصفت المضادة للB220 - PerCP ومعاداة CD8 - APC - Cy7 ومعاداة CD45.1 - PE - Cy7 الأضداد وهويشت 33258 وتحليلها ثم من جانب التدفق الخلوي (1،000،000 الأحداث التي تم جمعها). يعيش (هويشت 33258 --) ترد B220 - الخلايا في اللوحة اليسرى وبوابات CD8 + + CD45.1 الخلايا هو موضح في اللوحة اليمنى. والضوابط ، unstimulated CFSE المسمى CD8 + الخلايا التائية ، ويبين شدة CFSE من الخلايا غير المنقسمة ، في حين أن خلايا غير المسمى يبين لصناعة السيارات في مضان من الخلايا وحدود كشف الانقسامات الخلوية. علما بأن استخدام الفرق CD45 النمط الخيفي أمر حيوي في حل CD8 + نقل خلايا تي من المضيف ، لأنها هي مجموعة فرعية بسيطة من مجموع الخلايا التائية CD8 + (اللوحة اليسرى). علما أن معظم الخلايا تقع ضمن الحدود القصوى CFSE 7 في هذا المثال (اللوحة اليمنى) ، مشيرا إلى أن الخلايا قد خضعت تصل إلى 6 أقسام.
الشكل 1. قدرة CFSE المسمى ovalbumin (OVA) محددة T الخلايا المعدلة وراثيا مستقبلات CD8 + OT - I الخلايا التائية للرد في المختبر إلى العاصمة نابض مع تركيزات مختلفة من OVA ، وبيانات أظهرت أن بعد الثقافة 3 أيام. ملاحظة T + غير مقسمة سكان CD8 الخلايا في حالة عدم وجود مستضد (رمادي فاتح الرسم البياني) ، وصناعة السيارات في مضان من السكان غير المسمى (الرسم البياني الرمادي الداكن). يصور الشكل CD8 + الخلايا التائية التي قسمت 1-3 مرات على أساس تخفيف CFSE القمم ، مع المزيد من الخلايا T تقسيم في تركيزات أعلى مستضد.
الشكل 2. قدرة CFSE المسمى ovalbumin (OVA) محددة مستقبلات الخلايا التائية وراثيا CD8 + OT - I الخلايا التائية ، عندما نقل adoptively في الفئران C57BL / 6 للرد على OVA ، بيانات أظهرت 3 أيام بعد نقل بالتبني اللوحة اليسرى : CD8 + ، CD45. 1 + الخلايا T - 1 بعد التمديد في الفئران المتلقية. اللوحة اليمنى : CFSE ملف الانتشار النووي. علما غير ينقسم السكان من الخلايا التائية CD8 في الفئران لا يتلقى المستلم مستضد (رمادي فاتح الرسم البياني) ، وصناعة السيارات في مضان من الخلايا الليمفاوية غير المسمى (الرسم البياني الرمادي الداكن) +. يصور الشكل CD8 + الخلايا التائية التي قسمت 1-6 مرات على أساس تخفيف CFSE القمم.
الشكل 3. تمثيل الأحداث الجزيئية المختلفة التي تحدث أثناء توسيم الخلايا مع ثنائي الأسيتات carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFDA ، SE). للاطلاع على تفاصيل عملية مناقشة انظر النص. يستخدم 'CFSE" إن اختصار عامة ، وليس CFDA ، SE ، لوصف كاشف التوسيم وإجراءات وضع العلامات بشكل عام : المذكرة. الرقم استنادا باريش 4.
Discussion
لكي نقدر كيف ولماذا تعمل CFSE مطلوب السريع وسم موحدة لاستخدامها في تحليل انتشار الأسلحة النووية ، فإنه من المفيد لفهم الأساس الجزيئي للخلايا CFSE الوسم. ويمكن تقسيم هذه إلى مرحلتين ، 1) دخول الخلية و2) وضع العلامات البروتين (الشكل 3). 1) دخول الخلية : هو بوساطة دخول الصبغة إلى الخلية بواسطة النموذج diacetylated للصباغة ، carboxyfluorescein ثنائي الأسيتات succinimidyl استر (CFDA ، SE). والأسيتات جعل الصبغة نفيذ غشاء يسمح للغاية التمويه السريع عبر غشاء البلازما. Esterases والحاضر داخل الخلية ، ويلتصق من الأسيتات CFDA ، SE ، وبالتالي تؤدي إلى النموذج CFSE للصباغة الذي هو أقل بكثير نفيذ الغشاء ، وبالتالي التركيز على الصبغة داخل الخلية. 2) وضع العلامات البروتين : في حين أن كلا CFDA ، SE وCFSE الأمينية والتفاعل سلاسل الجانب succinimidyl ، فقط هو CFSE الفلورسنت. تركيز عال من الخلايا CFSE يسهل السريع وارتفاع مستوى الخلايا وسم من البروتينات. ويجب أن يؤدي وضع العلامات CFSE من الخلايا بسرعة من أجل الحصول على السكان المسمى متجانس من الخلايا ، وهو أمر حاسم لتسوية الخلايا التي تعرضت لانقسامات عدة كما هو موضح في نتائج ممثل (الشكل 1 و 2).
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد العمل التي أعلن عنها في هذه المادة من قبل الوطني للصحة ومجلس البحوث الطبية (NHMRC) في أستراليا برنامج المنحة (CRP) ومشروع NHMRC غرانت (CRP وBJCQ). كما BJCQ زميل بيتر دوهرتي NHMRC ما بعد الدكتوراه.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CFDA,SE | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| DMSO | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lymphocytes | eg mouse or human | ||
| RPMI | GIBCO, by Life Technologies | ||
| FCS | SAFC Global | ||
| 10-15ml conical tubes | Falcon BD | ||
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Aluminium foil | Capral Aluminium | ||
| Vortex | Scientific Industries Inc. | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer | BD Biosciences |
References
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171, 131-137 (1994).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. , (2009).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2, 2049-2056 (2007).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
