Summary
CFSE는 covalently 형광 염료, carboxyfluorescein와 긴 세포내 분자를 표시합니다. 따라서, CFSE - 표시 셀 분할 때, 그 자손 이는 세포 분열을 평가하는 데 사용할 수있는 형광의 절반 금액을 보유하고 있습니다. 이 문서는 일반적으로 CFSE와 마우스 lymphocytes를 라벨에 사용되는 절차를 설명합니다.
Abstract
Carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE)는 림프구 분열 1-3를 모니터할 수있는 효과적이고 인기있는 수단입니다. CFSE는 covalently 형광 염료, carboxyfluorescein와 긴 세포내 분자를 표시합니다. 따라서, CFSE - 표시 셀 분할 때, 그 자손은 carboxyfluorescein - 태그 분자의 절반 숫자 둘러 싸인하고 있으므로 각각의 세포 분열은 유동세포계측법를 통해 셀 형광에 해당 감소를 측정하여 평가하실 수 있습니다. 의 낮은 세포 독성과 결합된 매우 낮은 분산 높은 형광 강도와 림프구 인구, 라벨 CFSE의 용량은, 그 세포 분열을 측정하는 이상적인 염료합니다. 그것이 플루오레신 기반 염색이기 때문에 그것은 또한 멀티 컬러 유동세포계측법하는 것이 해당하는 다른 fluorochromes 광범와 호환됩니다. 이 문서는 일반적으로 8 셀 부문까지 감시하기위한 목적으로 마우스 lymphocytes를 라벨에 사용되는 절차를 설명합니다. 이 분류 세포는 체외에서 생체내 연구에 대해 모두 사용할 수 있습니다.
Protocol
1) 시약 설정
1.1) CFSE 주식 솔루션
CFSE의 염료는 일반적으로 25 MG의 튜브에 carboxyfluorescein 디아 세 테이트 succinimidyl 에스테르 (CFDA, SE) (MW 557.47 g / 두더지)로 구입합니다. (몇 개월 -20 ° C에서 50-100 μL aliquots로 저장) 5 mm의 최종 주식 솔루션 8.96 ML DMSO에 25 밀리그램을 디졸브. 이 같은 노출은 저장하는 동안 피해야하는 것이 중요하므로 CFDA, SE는 수용액과 반응합니다.
1.2) Lymphocytes
마우스의 비장 및 또는 림프절에서 lymphocytes 격리하고 함께 문화 매체 1 ML (예 : RPMI)에 resuspend 5% 열 inactivated (HI) 사이 0.5 × 10 6 세포 농도와 태아 송아지 혈청 (FCS), - 10 X 10 7 / ML.
2) CFSE 라벨
2.1) 정기 방법 :
- 완전히 새로운 (비 침수) 10 ML 원뿔 튜브의 바닥에 신중하게 중간과 장소의 하나 ML 볼륨에서 세포를 resuspend.
- (비 침수 튜브를 사용하여 이동하고 성급하게 CFDA, SE 솔루션을 혼합에서 한 ML - 세포 현탁액을 방지합니다) 수평 튜브를 놓는다.
- 조심스럽게 그것은 세포 솔루션과의 접촉을하지 않는 보장 튜브의 상단에있는 플라스틱 이외의 침수 부분에 PBS 110 μL를 추가합니다.
- 110 μL PBS에 CFDA, SE의 5 MM 주식 1.1 μL를 Resuspend.
- 신속 튜브 뚜껑 및 솔루션의 빠른 혼합 제복을 얻으려면 잘 반전하고 와동. CFSE의 염료 5 μm의의 최종 농도에됩니다 그러나, 최적 농도는 준비 각 배치에 대해 결정 할 수 있습니다, 그리고 그것이 효과가 있도록 6 개월마다 검사.
- 상온에서 5 분 세포를 품어. CFSE에 CFDA, SE의 전환시 (토론 참조) 염료는 형광등과 과도한 빛에 노출에 의해 표백에 따라서 경향이된다고합니다. 그러므로, 그것은 알루미늄 호일로 덮고하여 예를 들어,이 시점에서 빛으로부터 튜브를 보호하는 것이 좋습니다.
- 20 ° C와 폐기 뜨는에서 5 분 300 XG에서 원심 분리에 의해 sedimenting, 20 ° C PBS 5 % HI FCS를 포함 10 권 diluting하여 세포를 씻으십시오. 두 번 더 씻어 반복합니다.
(10도 이상의 휴대 전화 번호에 적합한 2.2) 대체 방법 - 30 X 10 7) :
- 1 PBS의 ML 신속하게 철저히 resuspended 세포 1 ML에 추가하기 위해 5 MM 주식 2 μL를 추가하여 2 X (10 μm의) CFDA, SE 솔루션을 준비하고 신속하게 튜브를 뚜껑과 반전 잘 소용돌이하려면 빠르고 균일 혼합.
- 상온에서 5 분 세포를 품어 및 단계 2.1 (F) 및 2.1 (G)에서와 같이 씻으십시오.
2.3) 전지는 다음 세포 분열의 유도에 대한 관심이 프로토콜에 적용할 수 있습니다. 라벨 세포는 체외에서 생체내의 assays에서 모두 사용할 수 있습니다.
2.4) 확산 분석의 완성에 세포가 수확되고 (대표 예제 아래 참조) 유동세포계측법으로 분석했다.
3) 대표 결과
CFSE 희석하여 림프구 증식을 평가하기 위해서는 본격적 세포 (즉, 최대 형광)이 아닌 표시된 셀 (예 : 최소 형광)의 형광을 알고 유용합니다. 따라서 귀하의 실험 설계는 계정에 이러한 컨트롤을해야합니다. 다음은 체외에서 유동세포계측법에 의해 CD8 + T 세포의 분열을 측정하는 CFSE를 사용하여 생체내 assays에의 예입니다.
시험 관내 자극에서 3.1)
그림 1의 CFSE 프로필을 보여줍니다 CFSE - 라벨 ovalbumin (OVA) - 구체적인 T 세포 수용체 유전자 변형 OVA의 다양한 양의와 펄스 돌기 세포 3 일 문화 이후 CD8 + OT - I T 세포. CD8 + OT - I 생쥐의 비장과 림프 노드에서 정화 T 세포가 CFSE 및 3.3 X 10 4 DC와 교양 1 X 10 5 세포로 분류되었습니다. DC 어디 37 1 시간에 대한 OVA ° C와 펄스와 문화 두 번 씻어 사전. 후 3 일 수확 및 레이블 방지 CD8 - APC 항체와 Hoechst 33258와 다음 유동세포계측법 (50000 이벤트가 수집)에 의해 분석 셀. 라이브는 (Hoechst 33258 -) CD8 + 세포가 표시됩니다. 비 표시된 세포가 자동 형광 세포가 감지 세포 분열의 한계를 보여줍니다 동안의 컨트롤로, 혼자 교양 CD8 + T 세포는, 비 나누어 세포의 CFSE 강도를 보여줍니다. 4 CFSE의 봉우리가 셀 3 부문까지받은 것을 나타내는이 예제에서 패널의 각 볼 수 있습니다.
생체내 자극에서 3.2)
그림 2는 생체내 3 일 후에 유전자 변형 CD8 + OT - I T 세포 CFSE - 분류 OVA 특정 T 세포 수용체의 CFSE 프로필을 보여줍니다 IN 20 μg의 OVA의 존재. CD8 + CD45.1 congenic OT - I 생쥐의 비장과 림프 노드에서 정화 T 세포가 CFSE 5 X 10 6 세포 C56BL/6J의 측면 꼬리 정맥 (CD45.2 +) 마우스로 IV를 주입으로 표시되었습니다. 2 시간 후 마우스 OVA 20 μg과 IV 주입했다. 삼일 후, 생쥐의 spleens는 안티 - B220 - PerCP, 안티 - CD8 - APC - Cy7 및 안티 CD45.1 - PE - Cy7 항체와 Hoechst 33258로 표시된, 단일 세포 현탁액으로 만든 수집하고 분석했다 유동세포계측법에 의해 (1,000,000 이벤트가 수집). 라이브 (Hoechst 33258는 -) B220 - 세포가 오른쪽 패널에 표시되는 왼쪽 패널과 문이 CD8 + CD45.1 + 세포에 표시됩니다. 컨트롤로, unstimulated CD8 CFSE - 표시 + T 세포가 아닌 나누어 세포의 CFSE 강도를 보여줍니다, 이외의 레이블이 붙은 세포가 세포가 감지 세포 분열의 한계의 자동 형광을 보여줍니다하는 동안. CD45 allotypic 차이의 사용이 전송 CD8를 해결 + 호스트에서 T 세포를, 그들은 전체 CD8 + T 세포 (왼쪽 패널)의 사소한 일부 아르로 매우 중요합니다. 대부분의 세포는 세포가 6 부문까지받은 것을 나타내는 예제 (오른쪽 패널) 7 CFSE의 봉우리 이내에 가을 있습니다.
그림 1. CFSE - 라벨 ovalbumin (OVA) - 구체적인 T 세포 수용체 유전자 변형 CD8 OVA의 다양한 농도와 펄스 DC로 체외에 대응 + OT - I T 세포, 삼일 문화 뒤에되고 그림 데이터. 참고 CD8가 아닌 나누어 인구 + T 능력 항원 (밝은 회색의 히스토그램)와 비 표시된 인구 (어두운 회색 히스토그램)의 자동 형광의 부재에서 세포. 그림 CD8을 모습 + 높은 항원 농도에 나누어 더 많은 T 세포와 CFSE 희석 봉우리에 따라 1-3 회 분할이 T 세포.
그림 2. 능력 CFSE - 라벨 ovalbumin (OVA) - 특정 adoptively OVA에 대응하는 C57BL / 6 마우스에 양도 T 세포 수용체 유전자 변형 CD8 + OT - I T 세포, 입양이 완료된 후 삼일 표시된 데이터는 왼쪽 패널 :. CD8 +, CD45. 받는 마우스 1 + OT - 1 T 세포. 오른쪽 패널 : CFSE 확산 프로필. CD8가 아닌 분할 인구 참고 +받는 생쥐의 T 세포는 항원 (밝은 회색의 히스토그램)와 비 표시된 lymphocytes (어두운 회색 히스토그램)의 자동 형광을받지 않습니다. 그림 CFSE 희석 봉우리에 따라 1-6 번 나누어 가지고 CD8 + T 세포를 묘사.
그림 3. carboxyfluorescein 디아 세 테이트 succinimidyl 에스테르 (CFDA, SE)와 함께 세포의 라벨 중에 발생하는 여러 가지 분자 이벤트의 표현. 프로세스에 대한 자세한 내용은 토론 텍스트를 참조하십시오. 참고 : 일반적인 약어 'CFSE'가 아닌 CFDA, SE는 일반적으로 라벨 시약 및 라벨 절차를 설명하는 데 사용됩니다. 파리쉬 4 기반의 그림.
Discussion
CFSE 작동 왜 빠른 균일한 라벨이 확산 분석의 사용하기 위해 필요한 것이 얼마나 감사하기 위해, 그것은 CFSE 셀 라벨의 분자 기초를 이해하는 데 유용합니다. 이것은 두 단계로, 1) 셀 항목과 2) 단백질 라벨 (그림 3)으로 나눌 수 있습니다. 1) 셀 입력 : 세포에 염색의 항목은 염료의 diacetylated 양식 carboxyfluorescein 디아 세 테이트 succinimidyl 에스테르 (CFDA, SE)에 의해 중재됩니다. acetates는 플라즈마 막 전체의 빠른 흐름을 허용 염료 높은 막 permeant합니다. 세포 내에서 현재 Esterases, 따라서 클리브 CFDA, SE에서 acetates 그리고 훨씬 더 적은 막 permeant있는 염료의 CFSE 양식을 일으키다가, 따라서 세포 내에 염료를 집중. 2) 단백질 라벨 : CFDA, SE 및 CFSE 모두 아미노 반응 succinimidyl 사이드 체인을 가지고 있지만, 오직 CFSE는 형광등입니다. CFSE의 높은 세포 농도는 단백질의 신속하고 높은 수준의 세포 라벨을 용이하게합니다. 세포의 CFSE 라벨은 대표적인 결과를 (그림 1 및 2)와 같이 여러 부서를받은 세포를 해결하기위한 중요 세포의 homogenously 라벨 인구를 얻기 위해 신속하게 수행되어야합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 문서에 보고된 사업은 국민 건강과 호주 프로그램 그랜트 (CRP)과 NHMRC 프로젝트 그랜트 (CRP 및 BJCQ)의 의학 연구 협의회 (NHMRC)에 의해 지원되었다. 또한 BJCQ은 NHMRC 피터 도허티 박사 과정 이수 연구원입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CFDA,SE | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| DMSO | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lymphocytes | eg mouse or human | ||
| RPMI | GIBCO, by Life Technologies | ||
| FCS | SAFC Global | ||
| 10-15ml conical tubes | Falcon BD | ||
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Aluminium foil | Capral Aluminium | ||
| Vortex | Scientific Industries Inc. | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer | BD Biosciences |
References
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171, 131-137 (1994).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. , (2009).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2, 2049-2056 (2007).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
