Summary
CFSE kovalent Etiketten langlebig intrazellulären Molekülen mit dem Fluoreszenzfarbstoff, Carboxyfluorescein. Als solche, als eine CFSE-markierten Zelle teilt, haben seine Nachkommen, die Hälfte der Menge der Fluoreszenz, die damit verwendet werden, um die Zellteilung zu beurteilen. Dieser Artikel beschreibt die Verfahren, die üblicherweise zur Kennzeichnung Maus-Lymphozyten mit CFSE verwendet.
Abstract
Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) ist ein effektives und beliebtes Mittel, um Lymphozyten Division 1-3 überwachen. CFSE kovalent Etiketten langlebig intrazellulären Molekülen mit dem Fluoreszenzfarbstoff, Carboxyfluorescein. Wenn also ein CFSE-markierten Zelle teilt, werden seine Nachkommen mit der Hälfte der Anzahl der Carboxyfluorescein-markierten Molekülen dotiert und damit jeder Zellteilung kann durch Messung der entsprechenden Abnahme der Zell-Fluoreszenz über Durchflusszytometrie beurteilt werden. Die Kapazität der CFSE auf Lymphozyten-Populationen mit hoher Fluoreszenzintensität von außergewöhnlich niedrigen Varianz, mit seinem niedrigen Zelltoxizität gekoppelt label, machen ihn zum idealen Farbstoff Zellteilung zu messen. Da es ein Fluorescein-basierte Farbstoff ist es ist auch kompatibel mit einer breiten Palette anderer Fluorochrome so dass es für Multi-Color-Durchflusszytometrie. Dieser Artikel beschreibt die Verfahren, die üblicherweise zur Kennzeichnung Maus-Lymphozyten für die Zwecke der Überwachung von bis zu 8 Zellteilungen verwendet. Diese markierten Zellen können sowohl für in vitro und in vivo-Studien verwendet werden.
Protocol
1) Reagenz-Setup
1,1) CFSE-Stammlösung
Die CFSE Farbstoff als Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFDA, SE) (MW 557,47 g / mol) gekauft, in der Regel in 25-mg-Durchstechflaschen. Lösen Sie die 25 mg in 8,96 ml DMSO für eine endgültige Stammlösung von 5 mM (speichern als 50-100 &mgr; l Aliquots bei -20 ° C für mehrere Monate). CFDA, SE wird mit wässriger Lösung reagieren so dass es wichtig ist, dass eine solche Exposition während der Lagerung vermieden werden.
1,2) Lymphozyten
Isolieren Lymphozyten aus Milz und Lymphknoten oder von Mäusen und resuspendieren in 1 ml Kulturmedium (z. B. RPMI) mit 5% hitzeinaktiviertem (HALLO) fötalem Kälberserum (FCS), mit einer Zellkonzentration von 0,5 x 06 bis 10 Oktober x 10 7 / ml.
2) CFSE Labeling
2,1) Routine-Methode:
- Gründlich die Zellen in der 1 ml Volumen Medium und Ort sorgfältig in den Boden einer frisch (nicht medienberührt) 10 ml konischen Rohr.
- Legen Sie das Rohr horizontal (mit einem nicht benetzte Rohr wird 1 ml-Zellsuspension aus bewegten und vorzeitig Vermischung mit dem CFDA, SE-Lösungen zu verhindern).
- Vorsichtig 110 ul PBS, die nicht benetzten Teil der Kunststoff an der Spitze des Rohres gewährleistet es keinen Kontakt mit der Zelle Lösung.
- Resuspendieren 1,1 ul der 5 mM Bestand CFDA, SE in den 110 ul PBS.
- Schnell Kappe der Röhre und invertieren und Vortex auch einen schnellen gleichmäßigen Durchmischung der Lösungen zu erhalten. Beachten Sie, dass die CFSE Farbstoff in einer Endkonzentration von 5 uM ist, jedoch kann die optimale Konzentration müssen für jede Charge vorbereitet bestimmt werden, und dann alle 6 Monate geprüft, um sicherzustellen, dass es wirksam ist.
- Inkubieren Zellen für 5 min bei Raumtemperatur. Beachten Sie, dass bei der Umwandlung von CFDA, SE CFSE (siehe Diskussion) der Farbstoff Fluoreszenz und somit anfällig für Bleichen von übermäßiger Licht wird. So ist es ratsam, das Rohr aus Licht von diesem Punkt zu schützen auf, z. B. durch Abdecken mit Alufolie.
- Wash-Zellen durch Verdünnung in 10 Bänden von 20 ° C PBS mit 5% FCS HALLO, Sedimentieren durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 20 ° C und der Überstand verworfen. Wiederholen Sie waschen zweimal.
2,2) Alternative Methode, die auch geeignet ist für höhere Zellzahlen (10 bis 30 x 10 7):
- Bereiten Sie eine 2 x (10 uM) CFDA, SE-Lösung durch Zugabe von 2 ul der 5 mM Lager zu 1 ml PBS und schnell fügen Sie diese zu 1 mL gründlich resuspendierten Zellen, dann schnell Kappe der Röhre und invertieren und Vortex gut zu bekommen schnelle gleichmäßige Durchmischung.
- Inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei Raumtemperatur und waschen wie in den Schritten 2,1 (f) und 2,1 (g).
2,3) Die Zellen können dann in einem Protokoll von Interesse für die Induktion der Zellteilung angewendet werden. Markierten Zellen können sowohl in in vitro und in vivo-Untersuchungen verwendet werden.
2,4) Nach Beendigung der Proliferation Assay werden Zellen geerntet und mittels Durchflusszytometrie analysiert (siehe unten für repräsentative Beispiele).
3) repräsentative Ergebnisse
Um zu beurteilen, Lymphozyten-Proliferation durch CFSE Verdünnung, ist es sinnvoll, die Fluoreszenz der ungeteilten Zellen (dh maximale Fluoreszenz) und nicht-markierte Zellen (dh minimale Fluoreszenz) kennen. Daher sollten Sie Ihre experimentellen Design dieser Kontrollen zu berücksichtigen. Nachfolgend sind Beispiele für in vitro und in vivo-Tests mit CFSE zu CD8 + T Zellteilung mittels Durchflusszytometrie gemessen.
3,1) In-vitro-Stimulation
Abbildung 1 zeigt die CFSE Profile von CFSE-markierten Ovalbumin (OVA)-spezifischen T-Zell-Rezeptor transgenen CD8 + OT-I T-Zellen nach 3 Tagen Kultur mit dendritischen Zellen mit verschiedenen Mengen von OVA gepulst. CD8 + T-Zellen aus der Milz und Lymphknoten von OT-I-Mäusen aufgereinigt wurden mit CFSE und 1 x 10 5 Zellen kultiviert mit 3,3 x 10 4 DC beschriftet. DC, wo mit OVA für 1 Stunde bei 37 ° C gepulst und zweimal vor dem Kultur. Nach 3 Tagen, Zellen, wo und mit anti-CD8-APC-Antikörper und Hoechst 33258 geerntet markiert und dann mittels Durchflusszytometrie analysiert (50.000 Veranstaltungen gesammelt). Live (Hoechst 33258 -) CD8 +-Zellen gezeigt werden. Als Kontrollen CD8 + T-Zellen kultiviert allein, zeigt die CFSE Intensität der nicht-geteilten Zellen, während die nicht-markierten Zellen zeigt die Autofluoreszenz der Zellen und die Grenzen der nachweisbaren Zellteilungen. Beachten Sie, dass 4 CFSE Gipfel in jede der Tafeln in diesem Beispiel zu sehen, was darauf hinweist, dass die Zellen bis zu 3 Divisionen unterzogen.
3,2) In-vivo-Stimulation
Abbildung 2 zeigt die CFSE Profile von CFSE-markierten OVA-spezifischen T-Zell-Rezeptor transgenen CD8 + OT-I T-Zellen nach 3 Tagen in vivo in die Anwesenheit von 20 ug OVA. CD8 + T-Zellen aus der Milz und Lymphknoten von CD45.1 kongene OT-I-Mäusen aufgereinigt wurden mit CFSE und 5 x 10 6 Zellen iv injiziert in die seitliche Schwanzvene C56BL/6J (CD45.2 +)-Mäuse bezeichnet. Nach 2 Stunden Mäusen injiziert wurden iv mit 20 ug OVA. Nach 3 Tagen wurden Milzen der Mäuse gesammelt, machte in einem einzigen Zellsuspension, beschriftet mit anti-B220-PerCP, anti-CD8-APC-Cy7 und anti-CD45.1-PE-Cy7 Antikörper und Hoechst 33258 und anschließend analysiert mittels Durchflusszytometrie (1.000.000 Ereignisse gesammelt). Live (Hoechst 33258 -) B220-Zellen sind in linken und gated CD8 + CD45.1 + Zellen im rechten Panel angezeigt gezeigt. Als Kontrollen unstimulierten CFSE-markierten CD8 + T-Zellen, zeigt die CFSE Intensität der nicht-geteilten Zellen, während die nicht-markierten Zellen zeigt die Autofluoreszenz der Zellen und die Grenzen der nachweisbaren Zellteilungen. Beachten Sie, dass die Verwendung des CD45 allotypische Unterschied entscheidend bei der Lösung der übertragenen CD8 + T-Zellen aus Host, da sie eine kleine Teilmenge der gesamten CD8 + T-Zellen (links) sind. Beachten Sie, dass die meisten Zellen innerhalb von 7 CFSE Gipfel in diesem Beispiel (rechts) fallen, was darauf hinweist, dass die Zellen bis zu 6 Divisionen unterzogen.
Abbildung 1. Die Fähigkeit von CFSE-markierten Ovalbumin (OVA)-spezifischen T-Zell-Rezeptor transgenen CD8 + OT-I T-Zellen in vitro zu DC mit verschiedenen Konzentrationen von OVA gepulsten reagieren, Daten gezeigt, dass nach 3 Tagen Kultur. Beachten Sie, nicht geteilt Bevölkerung von CD8 + T Zellen in Abwesenheit von Antigen (hellgrau Histogramm) und Auto-Fluoreszenz von nicht-markierten Bevölkerung (dunkelgrau Histogramm). Die Abbildung zeigt CD8 + T-Zellen, die 1-3 mal aufgeteilt wurden auf der Grundlage CFSE Verdünnung Gipfel mit mehr T-Zellen teilen bei den höheren Antigen-Konzentrationen.
Abbildung 2. Die Fähigkeit von CFSE-markierten Ovalbumin (OVA)-spezifischen T-Zell-Rezeptor transgenen CD8 + OT-I T-Zellen, wenn adoptiv in C57BL / 6 Mäuse übertragen, um OVA reagieren, Daten gezeigt, 3 Tage nach dem adoptiven Transfer Linke Tafel:. CD8 +, CD45. 1 + OT-1 T-Zellen in Empfängermäuse. Rechts: CFSE Verbreitung Profil. Hinweis nicht geteilt Bevölkerung von CD8 + T-Zellen in Empfängermäuse nicht erhalten Antigen (hellgrau Histogramm) und Auto-Fluoreszenz von nicht-markierten Lymphozyten (dunkelgrau Histogramm). Die Abbildung zeigt CD8 + T-Zellen, 1-6 mal aufgeteilt wurden auf der Grundlage CFSE Verdünnung Gipfel.
Abbildung 3. Eine Darstellung der verschiedenen molekularen Ereignisse, die während der Markierung von Zellen mit Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFDA, SE) auftreten. Für Einzelheiten des Verfahrens siehe Diskussion Text. Hinweis: Die generische Abkürzung "CFSE", nicht CFDA, SE, wird verwendet, um die Markierungsreagens und die Kennzeichnung Verfahren im Allgemeinen zu beschreiben. Abbildung basierend auf Parish 4.
Discussion
Um zu schätzen, wie CFSE funktioniert und warum schnelle einheitliche Kennzeichnung ist für den Einsatz in Proliferation Analyse erforderlich ist, ist es sinnvoll, die molekularen Grundlagen der CFSE Zellmarkierung verstehen. Dies kann in zwei Phasen, 1) Eindringen in die Zelle und 2) Protein-Labelling (Abbildung 3) eingeteilt werden. 1) Handy: Eintragung des Farbstoffes in der Zelle wird durch die diacetylierte Form des Farbstoffes, Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFDA, SE) vermittelt. Die Acetate machen den Farbstoff sehr Membran Permeationsmittel ermöglicht die rasche Wandel in der Plasmamembran. Esterasen, Gegenwart innerhalb der Zelle, spaltet die Acetate von CFDA, SE und damit Anlass zu der CFSE Form des Farbstoffes, die viel weniger Membran Permeationsmittel ist, so konzentriert sich der Farbstoff in der Zelle. 2) Protein Etikettierung: Während beide CFDA, SE und CFSE aminoreaktiven Succinimidyl Seitenketten haben, ist nur die CFSE Fluoreszenz. Die hohe intrazelluläre Konzentration von CFSE ermöglicht eine schnelle und hohe intrazelluläre Markierung von Proteinen. CFSE Markierung von Zellen müssen schnell durchgeführt werden, um eine homogen bezeichnet Population von Zellen, die entscheidend für die Lösung Zellen, die mehrere Abteilungen durchlaufen haben, wie in der repräsentativen Ergebnisse (Abb. 1 und 2) gezeigt, zu erhalten.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Arbeit in diesem Artikel berichtet, wurde von einem National Health and Medical Research Council (NHMRC) of Australia Programm Grant (CRP) und eine NHMRC Project Grant (CRP und BJCQ) unterstützt. Auch BJCQ ist ein NHMRC Peter Doherty Postdoctoral Fellow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CFDA,SE | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| DMSO | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lymphocytes | eg mouse or human | ||
| RPMI | GIBCO, by Life Technologies | ||
| FCS | SAFC Global | ||
| 10-15ml conical tubes | Falcon BD | ||
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Aluminium foil | Capral Aluminium | ||
| Vortex | Scientific Industries Inc. | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer | BD Biosciences |
References
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171, 131-137 (1994).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. , (2009).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2, 2049-2056 (2007).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
