Summary
KAKE kovalent, floresan boya, carboxyfluorescein uzun ömürlü hücre içi moleküller etiketler. Gibi KAKE etiketli hücre böler, döl ve böylece hücre bölünmesini değerlendirmek için kullanılan floresan yarısı miktarı, var. Bu makalede, tipik olarak KAKE fare lenfositler etiketlenmesi için kullanılan prosedürler açıklanmaktadır.
Abstract
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (KAKE) lenfosit bölümü 1-3 izlemek için etkili ve popüler bir araç . KAKE kovalent, floresan boya, carboxyfluorescein uzun ömürlü hücre içi moleküller etiketler. Böylece KAKE etiketli hücre bölünürken, onun nesillerinde carboxyfluorescein etiketli moleküllerinin yarısı numarası ile donatılmış ve böylece her bir hücre bölünmesi, Flow sitometri ile hücre floresan karşılık gelen azalma ölçerek tespit edilebilir. Düşük hücre toksisite ile birleştiğinde son derece düşük varyansın yüksek bir floresan yoğunluğu ile lenfosit toplulukları, etiket için KAKE kapasitesi, hücre bölünmesi ölçmek için ideal bir boya olun. Floresein bazlı boya olduğundan, aynı zamanda çok renkli akış sitometri uygulanabilir hale fluorochromes geniş bir yelpazesi ile uyumludur. Bu makale, genellikle fare lenfositler 8 hücre bölünmeleri kadar izleme amaçlı etiketlenmesi için kullanılan prosedürler açıklanmaktadır. Bu etiketli hücreleri in vitro ve in vivo çalışmalar için de kullanılabilir.
Protocol
1) Reaktif Kurulum
1.1) KAKE stok solüsyonu
KAKE boya genellikle 25 mg flakon carboxyfluorescein diasetat succinimidyl ester (CFDA, SE) (MW 557,47 g / mol) olarak satın alınmaktadır. (-20 ° C'de birkaç ay için 50-100 mcL alikotları olarak saklamak) 5 mM nihai bir stok solüsyonu için 8.96 mL DMSO 25 mg çözülür. Depolama sırasında bu tür bir poz kaçınılmalıdır kritik böylece CFDA, SE, sulu çözelti ile reaksiyona girer.
1.2) Lenfositler
Farelerin dalak ve lenf düğümleri ile 1 ml kültür ortamı (örneğin RPMI) lenfositlerin yalıtın ve tekrar süspansiyon arasında 0.5 x 10 6 hücre konsantrasyonu ile fetal buzağı serumu (FCS), - 10% 5 ısı ile inaktive edilmiş (HI) x 10 7 / ml.
2) KAKE Etiketleme
2.1) Rutin yöntemi:
- Dikkatlice taze (ıslatılmış) 10 ml konik tüp alt, orta ve yerin 1 ml hacmi iyice hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin.
- (Islak olmayan bir tüp kullanarak hareketli ve erken CFDA, GD çözümler ile karıştırılarak 1 ml hücre süspansiyonu önleyecektir) tüp yatay yatırın.
- Hücre çözümü ile temas yapmaz sağlanması tüpün üstündeki plastik olmayan ıslak kısmını dikkatlice PBS 110 mcL ekleyin.
- 110 mcL PBS CFDA, GD, 5 mM stokunun 1.1 mcL tekrar
- Hızla tüp kapağı ve çözümleri hızlı üniforma karıştırma almak için de ters ve vorteks. KAKE boya 5 mcM son bir konsantrasyonda olduğunu unutmayın, ancak, optimum konsantrasyonda hazırlanan her parti için belirlenecek, ve ardından etkili olduğundan emin olmak için her 6 ayda bir kontrol.
- Hücrelerin oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. CFDA, SE KAKE dönüştürülmesi üzerine (tartışma) boya, floresan ve böylece aşırı ışığa maruz tarafından beyazlatma eğilimli hale gelir. Bu nedenle, örneğin, alüminyum folyo ile kaplayıp, bu noktadan itibaren tüp ışıktan korumak için tavsiye edilir.
- Hücreleri, 20 ° C ve süpernatant atarak 5 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj yoluyla sedimenting, 20 ° C PBS% 5 HI FCS içeren 10 ciltlik seyreltilmesi ile yıkayın. Iki kez daha yıkayın tekrarlayın.
(10 daha yüksek hücre sayıları için de uygun olan 2.2) Alternatif yöntem, 30 x 10 7) :
- 5 mM stok 2 mcL 1 PBS ml ve 1 ml tamamen yeniden süspanse hücrelerin hızlı bir şekilde bu eklentiyi ekleyerek 2 x CFDA (10 mcM), GD çözüm hazırlayın, sonra hızlı bir şekilde tüpün kapağı ve ters ve vorteks almak hızlı üniforma karıştırma.
- Hücrelerin oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin ve adımları 2.1 (f) ve 2.1 (g) olarak yıkayın.
2.3) Hücreler daha sonra hücre bölünmesi indüksiyonu için bir ilgi protokolü uygulanabilir. Etiketli hücreleri hem de in vitro ve in vivo testleri kullanılabilir.
2.4) yayılması testin bitiminde, hücre hasat ve flow sitometri ile analiz (temsili örnekler için aşağıya bakınız).
3) Temsilci Sonuçlar
KAKE seyreltme lenfosit proliferasyonunu değerlendirmek için, bölünmemiş hücrelerinin (yani maksimum floresans) ve olmayan etiketli hücreleri (yani en az floresan) floresan bilmek yararlıdır. Bu nedenle, deney tasarımı, bu kontroller dikkate almalıdır. Aşağıda, in vitro ve in vivo deneylerde flow sitometri CD8 + T hücre bölünmesi ölçmek için KAKE kullanarak örnekler.
3.1 in vitro stimülasyon)
Şekil 1 KAKE profilleri gösterir KAKE-etiketli ovalbumin (OVA)-spesifik T hücre reseptörü transgenik OVA çeşitli miktarlarda darbeli dendritik hücreler ile 3 gün kültür sonra CD8 + OT-T hücreleri. CD8 + T hücreleri OT-I farelerin dalak ve lenf düğümleri arınmış KAKE ve 3.3 x 10 4 DC kültürlü 1 x 10 5 hücreleri ile etiketlenir. DC 37 ° C 1 saat için OVA ile darbeli ve kültüre önce iki kez yıkanır. 3 gün sonra, hasat ve etiketli anti-CD8-APC antikorlar ve Hoechst 33.258 ve daha sonra analiz flow sitometri (50.000 olaylar toplanan) hücreler. Live (Hoechst 33.258 -) CD8 + hücreler gösterilmiştir. Etiketli hücre hücre ve sınırlarını tespit hücre bölünmeleri floresan otomatik gösterirken, kontrol grubu olarak, tek başına kültür CD8 + T hücreleri, olmayan bölünen hücrelerden KAKE yoğunluğunu gösterir. 4 KAKE doruklarına, bu örnekte, paneller her hücreleri 3 bölümler uğramadığını belirten görülebilir olduğunu unutmayın.
3.2 in vivo stimülasyon)
Şekil 2 transgenik CD8 + OT-T hücrelerinin in vivo olarak 3 gün sonra KAKE etiketli OVA-spesifik T hücre reseptör KAKE profilleri gösterir In 20 mg OVA varlığı. CD8 + T hücreleri CD45.1 congenic OT-I farelerin dalak ve lenf düğümleri arınmış KAKE ve 5 x 10 6 hücre içine iv enjekte C56BL/6J lateral kuyruk ven (CD45.2 +), farelerde ile etiketlenir . , 2 saat fareler sonra 20 mg OVA iv enjekte edildi. 3 gün sonra fareler dalak, anti-B220-PerCP anti-CD8-APC-Cy7 ve anti-CD45.1-PE-Cy7 antikorlar ve Hoechst 33.258 ile etiketlenmiş, bir tek hücre süspansiyonu haline getirilmiş, toplanan ve daha sonra analiz edildi flow sitometri (1.000.000 olaylar toplanan). Live (Hoechst 33.258 -) B220-hücreleri sağ panelde gösterilen sol paneli ve kapılı CD8 + CD45.1 + hücreler gösterilmiştir. Kontrol grubu olarak, unstimulated CD8 KAKE etiketli + T hücreleri, bölünen hücrelerden KAKE yoğunluğunu gösterir olmayan etiketli hücreleri, hücreler ve sınırlarını tespit hücre bölünmeleri otomatik floresan gösterir. CD45 allotypic fark devredilen konak çözme CD8 + T hücreleri, toplam CD8 + T hücreleri (sol panel) küçük bir alt kümesi olarak hayati olduğunu unutmayın. En hücreler hücreleri 6 bölünmelere uğramadığını belirterek, bu örnek (sağ panel) 7 KAKE doruklarına giren unutmayın.
Şekil 1. KAKE-işaretli ovalbumin (OVA)-spesifik T hücre reseptör transgenik CD8 Not OVA, farklı konsantrasyonları ile darbeli DC in vitro cevap için + OT-I T hücreleri,, 3 gün kültür sonra gösterilen veriler. CD8 olmayan-bölünmüş nüfus + T yeteneği antijen (açık gri histogram) ve oto-floresan etiketli olmayan nüfus (koyu gri histogram) yokluğunda hücre. Şekil gösteriyor CD8 + T hücreleri, T hücreleri yüksek antijen konsantrasyonlarda bölünmesi, KAKE seyreltme doruklarına göre 1-3 kez bölünmüş var.
Şekil 2. Yeteneği KAKE-işaretli ovalbumin (OVA)-özel adoptively OVA için cevap C57BL / 6 farelerinde içine transfer T hücre reseptör transgenik CD8 + OT-I T hücreleri,, evlatlık transferi sonrası 3 gün gösterilen veri Sol paneli:. CD8 +, CD45. alıcı farelerde 1 + OT-1 T hücreleri. Sağ panel: KAKE çoğalması profili. Not CD8 olmayan bölünmüş nüfus + alıcı farelerde T hücreleri antijen (açık gri histogram) ve otomatik olmayan etiketli lenfositleri (koyu gri histogram) floresan almıyor. Şekil KAKE seyreltme doruklarına göre 1-6 kez bölünmüş CD8 + T hücreleri gösteriyor.
Şekil 3. Tartışma metin carboxyfluorescein diasetat succinimidyl ester (CFDA, SE) ile hücrelerin etiketleme sırasında meydana gelen çeşitli moleküler olayların bir temsili. Süreçle ilgili ayrıntılar için bkz. Not: genel kısaltma 'KAKE' değil, CFDA, SE, genel etiketleme reaktif ve etiketleme işlemi tanımlamak için kullanılır. Parish 4 dayalı Şekil.
Discussion
KAKE çalıştığını ve neden hızlı üniforma etiketleme çoğalması analizinde kullanılmak üzere gerekli nasıl takdir için, KAKE hücre etiketleme moleküler temelini anlamak için yararlıdır. Bu iki faz, 1) Hücre giriş ve 2) Protein etiketleme (Şekil 3) ayrılabilir. 1) Hücre giriş: Giriş hücre boya boya diacetylated formu, carboxyfluorescein diasetat succinimidyl ester (CFDA, SE) aracılığı ile. Asetatlar plazma zarından hızlı akı sağlayan boya yüksek membran permeant olun. Böylece hücre içinde bulunan esterazlar, böylece tutunmaya CFDA, SE asetatlar ve daha az membran permeant boya KAKE formu doğuran, hücre içinde konsantre boya. 2) Protein etiketleme: CFDA, SE ve KAKE hem de amino-reaktif succinimidyl yan zincirler olmasına rağmen, sadece KAKE floresan. KAKE yüksek hücre içi konsantrasyonu hızlı ve proteinlerin yüksek düzeyde hücre içi etiketleme kolaylaştırır. Hücre KAKE etiketleme temsilcisi sonuçları (Şekil 1 ve 2) 'de gösterildiği gibi birçok bölünmeler geçiren hücreler çözmek için kritik hücre etiketli homojen bir nüfus, elde etmek için hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu yazıda, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC), Avustralya Programı Hibe (CRP) ve NHMRC Projesi Hibe (CRP ve BJCQ) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca BJCQ NHMRC Peter Doherty doktora sonrası çalışmalarını yürütüyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CFDA,SE | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| DMSO | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lymphocytes | eg mouse or human | ||
| RPMI | GIBCO, by Life Technologies | ||
| FCS | SAFC Global | ||
| 10-15ml conical tubes | Falcon BD | ||
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Aluminium foil | Capral Aluminium | ||
| Vortex | Scientific Industries Inc. | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer | BD Biosciences |
References
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171, 131-137 (1994).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. , (2009).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2, 2049-2056 (2007).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
