Summary
CFSE covalently फ्लोरोसेंट डाई, carboxyfluorescein के साथ लंबे समय रहते intracellular अणुओं लेबल. जैसे, जब एक CFSE लेबल सेल बिताते हैं, अपनी संतान प्रतिदीप्ति के आधे राशि है, जो जिससे कोशिका विभाजन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह आलेख आमतौर पर CFSE के साथ माउस लिम्फोसाइटों लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं का वर्णन करता है.
Abstract
Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) एक प्रभावी और लोकप्रिय लिम्फोसाइट विभाजन 1-3 की निगरानी का मतलब है . CFSE covalently फ्लोरोसेंट डाई, carboxyfluorescein के साथ लंबे समय रहते intracellular अणुओं लेबल. इस प्रकार, जब एक CFSE लेबल सेल बिताते हैं, अपनी संतान carboxyfluorescein टैग अणुओं की आधी संख्या के साथ संपन्न होते हैं और इस प्रकार प्रत्येक कोशिका विभाजन cytometry प्रवाह के माध्यम से सेल प्रतिदीप्ति में इसी कमी को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. CFSE की क्षमता को असाधारण कम विचरण का एक उच्च फ्लोरोसेंट तीव्रता के साथ लिम्फोसाइट आबादी अपनी कम सेल विषाक्तता के साथ मिलकर लेबल, यह कोशिका विभाजन को मापने के लिए एक आदर्श डाई बनाने के. चूंकि यह एक fluorescein आधारित डाई है यह भी अन्य यह बहु रंग प्रवाह cytometry के लिए लागू करने fluorochromes के एक व्यापक रेंज के साथ संगत है. यह लेख आम तौर पर 8 कोशिका विभाजन के लिए निगरानी के प्रयोजन के लिए माउस लिम्फोसाइटों लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं का वर्णन करता है. ये लेबल कोशिकाओं के लिए इन विट्रो में और vivo अध्ययन में दोनों इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
1) अभिकर्मक सेटअप
1.1) CFSE शेयर समाधान
CFSE डाई carboxyfluorescein diacetate succinimidyl (CFDA, एसई) एस्टर (मेगावाट 557.47 जी / तिल) के रूप में खरीदा है, आमतौर पर 25 मिलीग्राम शीशियों में. 8.96 एमएल DMSO में 5 मिमी की एक अंतिम स्टॉक समाधान (5-10 कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर μL aliquots के रूप में की दुकान) के लिए 25 मिलीग्राम भंग. CFDA, एसई, जलीय घोल के साथ प्रतिक्रिया है इसलिए यह महत्वपूर्ण है है कि भंडारण के दौरान इस तरह के जोखिम से बचा जा.
1.2) लिम्फोसाइटों
प्लीहा और चूहों से या लिम्फ नोड्स से लिम्फोसाइटों पृथक और संस्कृति के माध्यम से 1 एमएल (जैसे RPMI) के साथ में resuspend 5% गर्मी निष्क्रिय (HI) के 0.5 के बीच x 10 6 के एक सेल एकाग्रता के साथ में भ्रूण बछड़ा (FCS), सीरम - 10 x 10 7 एमएल /.
2) CFSE लेबल
2.1) नियमित विधि:
- अच्छी तरह से 1 मध्यम और जगह के एमएल एक ताजा (गैर गीला) 10 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के नीचे में ध्यान मात्रा में कोशिकाओं resuspend.
- ट्यूब क्षैतिज लेटाओ (गैर गीला ट्यूब का उपयोग कर चलती है और समय से पहले CFDA, एसई समाधान के साथ मिश्रण से 1 एमएल सेल निलंबन को रोकने जाएगा).
- ध्यान सुनिश्चित करना है यह सेल समाधान के साथ संपर्क नहीं कर सकता है ट्यूब के शीर्ष पर गैर गीला प्लास्टिक के हिस्से पीबीएस के 110 μL जोड़ें.
- CFDA, एसई 110 μL पीबीएस में 5 मिमी स्टॉक के 1.1 μL Resuspend.
- जल्दी ट्यूब टोपी और पलटना और भंवर अच्छी तरह से करने के लिए त्वरित समाधान के मिश्रण वर्दी. ध्यान दें कि CFSE डाई 5 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता में है, तथापि, इष्टतम एकाग्रता तैयार प्रत्येक बैच के लिए निर्धारित किया है, और हो सकता है तो हर 6 महीने की जाँच यह सुनिश्चित करने के प्रभावी है.
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं. ध्यान दें कि CFSE CFDA, एसई के लिए रूपांतरण पर (चर्चा देखें) फ्लोरोसेंट डाई और इस प्रकार अत्यधिक प्रकाश के संपर्क द्वारा विरंजन के लिए ग्रस्त हो जाता है. इस प्रकार, यह सलाह दी जाती है इस बिंदु से प्रकाश से ट्यूब, रक्षा उदाहरण के लिए यह एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर के द्वारा.
- 20 · सी पीबीएस 5% हाई FCS के 10 खंडों में गिराए, 20 डिग्री सेल्सियस और discarding सतह पर तैरनेवाला पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा sedimenting द्वारा कोशिकाओं को धो लें. दोहराएँ दो बार धोने.
2.2) वैकल्पिक विधि है, जो भी उच्च सेल नंबर के लिए उपयुक्त है (10 - 30 x 10 7 ):
- पीबीएस के 1 एमएल और जल्दी से अच्छी तरह resuspended कोशिकाओं के 1 एमएल जोड़ने के लिए 5 मिमी शेयर के 2 μL जोड़कर एक 2 x (10 सुक्ष्ममापी) CFDA, एसई समाधान तैयार करने के लिए, तो जल्दी ट्यूब टोपी और पलटना और अच्छी तरह भंवर को मिल त्वरित वर्दी मिश्रण.
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं और 2.1 (च) और 2.1 (छ) कदम के रूप में धो.
2.3) कोशिकाओं को फिर कोशिका विभाजन के शामिल होने के लिए ब्याज की एक प्रोटोकॉल के लिए लागू किया जा सकता है. लेबल कोशिकाओं दोनों इन विट्रो में और vivo assays में इस्तेमाल किया जा सकता है .
2.4) प्रसार परख के पूरा होने पर, कोशिकाओं काटा और प्रवाह cytometry से विश्लेषण कर रहे हैं (प्रतिनिधि उदाहरण के लिए नीचे देखें).
3) प्रतिनिधि परिणाम
CFSE कमजोर पड़ने द्वारा लिम्फोसाइट प्रसार का आकलन करने के लिए, यह अविभाजित (यानी अधिकतम प्रतिदीप्ति) कोशिकाओं और गैर लेबल कोशिकाओं (यानी न्यूनतम प्रतिदीप्ति) के प्रतिदीप्ति पता करने के लिए उपयोगी है. इसलिए, अपने प्रयोगात्मक डिजाइन खाते में इन नियंत्रण रखना चाहिए. नीचे के इन विट्रो में और vivo में CFSE प्रवाह cytometry द्वारा CD8 + टी कोशिका विभाजन को मापने का उपयोग assays में उदाहरण हैं.
इन विट्रो उत्तेजना में) 3.1
चित्रा 1 के CFSE प्रोफाइल से पता चलता है CFSE लेबल ovalbumin (OVA) विशिष्ट टी सेल रिसेप्टर OVA के विभिन्न मात्रा के साथ स्पंदित वृक्ष के समान कोशिकाओं के साथ ट्रांसजेनिक CD8 + टी ओ.टी. मैं 3 दिनों संस्कृति के बाद कोशिकाओं. CD8 + टी कोशिकाओं ओ.टी. मैं चूहों के प्लीहा और लिम्फ नोड्स से शुद्ध CFSE और 1 x 10 5 3.3 x 10 4 डीसी के साथ संवर्धित कोशिकाओं के साथ लेबल रहे थे. 1 घंटे के लिए 37 ओवीए ° सी के साथ डीसी जहां स्पंदित और संस्कृति के लिए दो बार पहले धोए. के बाद 3 दिन, कोशिकाओं, जहां काटा और लेबल और विरोधी CD8-APC एंटीबॉडी और 33,258 Hoechst के साथ तब प्रवाह cytometry (50,000 घटनाओं एकत्र) से विश्लेषण. लाइव (33,258 Hoechst) CD8 + कोशिकाओं को दिखाए जाते हैं. नियंत्रण के रूप में, CD8 + टी अकेले संवर्धित कोशिकाओं, गैर विभाजित कोशिकाओं के CFSE तीव्रता से पता चलता है, जबकि गैर - लेबल की कोशिकाओं ऑटो प्रतिदीप्ति कोशिकाओं और detectable सेल डिवीजनों की सीमा से पता चलता है. ध्यान दें कि इस उदाहरण में पैनलों में से प्रत्येक में 4 CFSE चोटियों देखा जा सकता है, यह दर्शाता है कि कोशिकाओं 3 डिवीजनों के लिए आया है.
Vivo में उत्तेजना में) 3.2
मैं चित्रा 2 CFSE लेबल OVA विशेष टी सेल रिसेप्टर के CFSE प्रोफाइल vivo में 3 दिनों के बाद ट्रांसजेनिक CD8 कोशिकाओं + टी ओ.टी. मैं से पता चलता हैn 20 μg OVA की उपस्थिति. CD8 + टी कोशिकाओं CD45.1 congenic ओ.टी. मैं चूहों की प्लीहा और लिम्फ नोड्स से शुद्ध CFSE और 5 x 10 6 कोशिकाओं C56BL/6J के पार्श्व पूंछ नस (CD45.2 +) चूहों में चार इंजेक्शन के साथ लेबल रहे थे . 2 घंटा चूहों के बाद चार OVA के 20 μg साथ अंतःक्षिप्त थे. 3 दिनों के बाद चूहों से spleens एकत्र थे, एक एकल कक्ष निलंबन में बनाया, विरोधी B220 - PerCP, विरोधी CD8-APC-Cy7 और विरोधी CD45.1 पीई Cy7 एंटीबॉडी और Hoechst 33258 के साथ लेबल और फिर विश्लेषण प्रवाह cytometry द्वारा (हज़ार हज़ार घटनाओं एकत्र). लाइव (33,258 Hoechst -) B220 कोशिकाओं बाईं पैनल और gated CD8 CD45.1 + + कोशिकाओं राइट पैनल में दिखाया गया है में दिखाया जाता है. नियंत्रण के रूप में, unstimulated CD8-CFSE लेबल + टी कोशिकाओं, गैर विभाजित कोशिकाओं के CFSE तीव्रता से पता चलता है, जबकि गैर - लेबल कोशिकाओं कोशिकाओं और detectable सेल डिवीजनों की सीमा के ऑटो प्रतिदीप्ति से पता चलता है. ध्यान दें कि CD45 allotypic अंतर का उपयोग हस्तांतरित CD8 हल + मेजबान से टी कोशिकाओं, के रूप में वे कुल CD8 + टी कोशिकाओं (बाएं पैनल) की एक छोटी सी सबसेट में महत्वपूर्ण है. ध्यान दें कि सबसे कोशिकाओं 7 इस उदाहरण में (सही पैनल) में CFSE चोटियों के भीतर गिर जाते हैं, यह दर्शाता है कि कोशिकाओं 6 प्रभागों के लिए आया है.
चित्रा 1. CFSE - लेबल ovalbumin (OVA) - विशिष्ट टी सेल रिसेप्टर सीडी 8 ट्रांसजेनिक + ओ.टी. मैं - टी डीसी के लिए इन विट्रो OVA के विभिन्न सांद्रता के साथ स्पंदित में जवाब कोशिकाओं, 3 दिनों संस्कृति के बाद किया जा रहा दिखाया गया डेटा. नोट गैर - विभाजित CD8 की जनसंख्या + टी क्षमता (हल्के भूरे रंग हिस्टोग्राम) प्रतिजन और जनसंख्या गैर - लेबल (अंधेरे ग्रे हिस्टोग्राम) ऑटो प्रतिदीप्ति के अभाव में कोशिकाओं. चित्रा दर्शाया गया है CD8 + टी कोशिकाओं है कि 1-3 बार CFSE कमजोर पड़ने चोटियों पर आधारित विभाजित है उच्च सांद्रता में प्रतिजन टी कोशिकाओं को विभाजित के साथ,.
चित्रा 2. की क्षमता CFSE - लेबल ovalbumin (OVA) - विशेष टी सेल रिसेप्टर ट्रांसजेनिक CD8 + ओ.टी. - मैं टी कोशिकाओं, जब adoptively C57BL / 6 चूहों में हस्तांतरित OVA करने के लिए जवाब है, दत्तक हस्तांतरण के बाद 3 दिन दिखाया डेटा वाम पैनल: सीडी 8 +, CD45. . प्राप्तकर्ता चूहों में 1 + ओ.टी.-1 टी कोशिकाओं. राइट पैनल: CFSE प्रसार प्रोफ़ाइल. गैर विभाजित CD8 की आबादी नोट + प्राप्तकर्ता चूहों में टी कोशिकाओं (हल्के भूरे रंग हिस्टोग्राम) प्रतिजन और गैर - लेबल (अंधेरे ग्रे हिस्टोग्राम) लिम्फोसाइटों ऑटो प्रतिदीप्ति प्राप्त नहीं है. चित्रा CD8 + टी कोशिकाओं है कि 1-6 बार CFSE कमजोर पड़ने चोटियों पर आधारित विभाजित है दर्शाया गया है.
चित्रा 3. विभिन्न आणविक घटनाओं है कि carboxyfluorescein diacetate succinimidyl एस्टर (CFDA, एसई) के साथ कोशिकाओं की लेबलिंग के दौरान होने की एक प्रक्रिया के विवरण के लिए. प्रतिनिधित्व चर्चा पाठ देखते हैं. नोट: सामान्य परिवर्णी शब्द 'CFSE के' CFDA, एसई, नहीं, लेबलिंग और सामान्य में लेबलिंग प्रक्रिया अभिकर्मक का वर्णन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. चित्रा 4 पैरिश पर आधारित है.
Discussion
आदेश में कैसे CFSE काम करता है और तेजी से वर्दी लेबलिंग प्रसार के विश्लेषण में इसके उपयोग के लिए क्यों आवश्यक है की सराहना करने के लिए, यह उपयोगी है CFSE सेल लेबलिंग के आणविक आधार को समझने के लिए. यह दो चरणों 1) सेल प्रविष्टि और 2) प्रोटीन लेबलिंग (चित्रा 3) में विभाजित किया जा सकता है. 1) सेल प्रविष्टि: सेल करने के लिए डाई के प्रवेश डाई के diacetylated फार्म, carboxyfluorescein diacetate succinimidyl एस्टर (CFDA, एसई) द्वारा मध्यस्थता है. एसीटेट डाई अत्यधिक झिल्ली permeant प्लाज्मा झिल्ली भर में तेजी से प्रवाह की अनुमति. Esterases, कक्ष के भीतर मौजूद है, फोड़ना CFDA, एसई से एसीटेट और जिससे डाई जो बहुत कम झिल्ली permeant है के CFSE फार्म को जन्म दे, इस प्रकार कोशिका के भीतर डाई ध्यान दे. 2) प्रोटीन लेबलिंग: जबकि दोनों CFDA, एसई और CFSE अमीनो प्रतिक्रियाशील succinimidyl पक्ष श्रृंखला है, केवल CFSE फ्लोरोसेंट है. CFSE के उच्च intracellular एकाग्रता प्रोटीन के तेजी से और उच्च स्तर के intracellular लेबलिंग की सुविधा. कक्षों की CFSE लेबलिंग जल्दी प्रदर्शन किया जाना चाहिए क्रम में करने के लिए कक्षों की एक homogenously लेबल जनसंख्या है, जो कोशिकाओं है कि कई डिवीजनों आया है प्रतिनिधि परिणाम (चित्रा 1 और 2) के रूप में दिखाया गया है को हल करने के लिए महत्वपूर्ण है प्राप्त.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस आलेख में काम की रिपोर्ट एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य और ऑस्ट्रेलिया प्रोग्राम (सीआरपी) के अनुदान और NHMRC परियोजना अनुदान (सीआरपी और BJCQ) के चिकित्सा अनुसंधान परिषद (NHMRC) के द्वारा समर्थित किया गया. इसके अलावा BJCQ NHMRC पीटर Doherty Postdoctoral फैलो है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CFDA,SE | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| DMSO | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lymphocytes | eg mouse or human | ||
| RPMI | GIBCO, by Life Technologies | ||
| FCS | SAFC Global | ||
| 10-15ml conical tubes | Falcon BD | ||
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Aluminium foil | Capral Aluminium | ||
| Vortex | Scientific Industries Inc. | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer | BD Biosciences |
References
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171, 131-137 (1994).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. , (2009).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2, 2049-2056 (2007).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
